BioTechnicalフォーラム [トランスフェクト]

2回目のトランスフェクションで発現量が上がる可能性はあります。
ただ、
今の細胞株で、高濃度の薬剤セレクションによる遺伝子増幅をかけることが出来るかもしれません。
細胞株やベクター系の改良で発現量を上げることが可能かもしれません。
培養条件の改良で発現量を上げることが可能かもしれません。
そのような複数ある発現量の向上方法の中で、2回目のトランスフェクションを優先的に選択することは私はしません。

>これまでの経験上このタンパク質は今以上に分泌してきてもおかしくないので
これの根拠が何かによりますが、新しい細胞株にトランスフェクションしなおして、細胞株を取り直すのも手だと思いますけど。
"はずれ"の発現株に執着する必要も無いと思いますし。

(無題)

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No.602-14 - 2011/07/05 (火) 20:21:11 - おお

分泌タンパクであれば小ほう輸送、とう鎖修飾などの酵素の飽和などもからんでくるのでプラスミドがいっぱい入ってmRNAがたくさん合成されればいいと言うより、その他の改善が必要かもしれません。

(無題)

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No.602-13 - 2011/07/05 (火) 18:40:21 - rundoll

皆様ありがとうございます。
今回は一般的な分泌タンパク質をより多く取りたいという目的です。
決して分泌しにくいものではないですが、スケールアップはお金がかかるので回避したいというのが現状です。
これまでの経験上このタンパク質は今以上に分泌してきてもおかしくないので、より高発現株を取るのに２重トランスフェクトは有効かどうかご意見をお聞きしたかったのです。
書けないことが色々あってなかなか説明が難しいですね..

(無題)

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No.602-12 - 2011/07/05 (火) 08:23:02 - Harmonia

で、トピ主さんの標的遺伝子は、発現量が上がることが期待されるのでしょうか？

プラスミドのコピー数が増えれば、転写量が増えることは期待できます。
でも、翻訳とか翻訳後修飾とか、存在する蛋白質量となると、遺伝子産物ごとに事情があるでしょう。MG132を入れないと見えない蛋白質もあるし。

その遺伝子産物の文献情報を集めてください。

(無題)

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No.602-11 - 2011/07/04 (月) 08:57:54 - ~

否定的というか、何をしたいのかが明らかにされていないから、あまり肯定的に書けないのだと思いますが。

物取りであれば、2回目のトランスフェクションとスケールアップのどちらが効率的かを考える必要があるでしょうし、
フェノタイプを見るのであれば、2回のトランスフェクションで生き残ってきた細胞というバイアスをどう考慮するかを事前に考えておく必要があるでしょう。

(無題)

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No.602-10 - 2011/07/02 (土) 21:09:24 - 理屈上は

私は、肯定派です。培地に入れるタイプ（Fugene6）で、３日後に、もう一回やると発現効率はかなりあがりますよ。
トランジェントで、発現を６日ほどもたせたいというなら、いい方法です。

ただ、オーバーExpressionになりやすいので、目的によっては向きません。また、ステイブルで発現がゼロ近くまで下がるというのなら、これも良くあることで、、、その直列方法はあまり役に立たないかもしれません。

(無題)

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No.602-9 - 2011/07/02 (土) 15:10:07 - おお

>[Re:8] rundollさんは書きました :

> ちなみにその後シングルクローン化しております。
> その細胞にさらにトランスフェクトしたらどうだろうかと思ったのですが、
> やはり効果は薄そうですね。

一過性のトランスフェクションで入るプラスミドの量は効率のいい細胞では可也多いみたいです。セレクションして安定株にするとその中の一部がゲノムに入るわけですから、仰るような状況では場合によっては高い発現を期待できるかもしれません。ただそれをするんであったら、安定株でなくて元の細胞にトランスフェクションすればどうかとも思います。その効率とほとんどかわらない可能性がありますから。

得られたクローンがよくトランスフェクトされた結果できたものだから、その細胞は効率がいいという考えなら、分かりません。薬剤選択やクローンからまた多様性を獲得しているとおもえますので。予備実験をやってみてもいいかもしれませんよ。

(無題)

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No.602-8 - 2011/07/02 (土) 14:49:55 - rundoll

おお様
ありがとうございます。
私がやっているのはまさに培地にいれたまま2,3日放置の方法です。
ちなみにその後シングルクローン化しております。
その細胞にさらにトランスフェクトしたらどうだろうかと思ったのですが、
やはり効果は薄そうですね。

(無題)

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No.602-7 - 2011/07/02 (土) 00:28:57 - おお

最近のトランスフェクションようの試薬はバイチに入れたまま培養するというプロトコールがおおいです。
そういう意味では2回のトランスフェクションににているかもしれません。
ぎゃくにこのようなプロトコールなら2回やるのはどこまで効果的かわかりませんね。
発現維持を考えるんだったら物によっては安定発現細胞株を作ってもいいかもしれません。

(無題)

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No.602-6 - 2011/07/01 (金) 18:21:09 - rundoll

皆様ありがとうございます。
否定的な意見が多いでしょうか。
まあ、トランスフェクトを繰り返すことで発現量、分泌量がどんどん上がっていくなら大量発現系で誰も苦労しないし、すでに一般的になっていてもおかしくないですよね。

(無題)

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No.602-5 - 2011/07/01 (金) 13:44:51 - KY

その効果とは？目的によると思いますが。

どんなに効率的に2回目のトランスフェクションがうまくいっても、1回トランスフェクションより2倍以上の発現になるとは思えない。
普通に考えると、確率的に同じ細胞にも再度トランスフェクションされるので、同じプロモーターを使用している限り、プラスミド量が倍になっても、単純に発現が2倍になるとはならないでしょう。
2回トランスフェクションで１回のときよりも1.5倍ぐらいになったとして、
それで質問者さんのみたい現象が見れると思われるのであれば、行ってみるとよいでしょう。

(無題)

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No.602-4 - 2011/07/01 (金) 11:28:50 - ats

導入効率の向上なら、クロロキン添加という手もありますよ（毒性があるため除去が必要ですが）。

(無題)

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No.602-3 - 2011/07/01 (金) 10:40:07 - ~

効果がある場合はあります。
セレクションがかけられるように、2回目のベクターには異なる薬剤耐性遺伝子を入れる場合もあります。

ただ、条件が少々トリッキーになるので、ベクター系を改良して1回目のトランスフェクションで目的の発現量に出来る方向で進めたほうがいいと思いますけど。

(無題)

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No.602-2 - 2011/07/01 (金) 07:04:29 - おお

siRNAでは時折やられているようですね。