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核移行シグナルの選択 トピック削除
No.597-TOPIC - 2011/06/30 (木) 03:25:27 - Toronton
現在実験で使っているタンパクに核移行シグナルを付加してみました。
もともとのタンパクのN末にGFPを付加したのですが、さらにそのN末にSV40をタグしたところ（すなわちSV40−GFP-目的タンパクという配列）、GFPのコンフォメーションに影響を及ぼすらしく、タンパク発現量に比べてGFPのシグナルが非常に弱くなってしまいました。
このタンパクの性質上、C末にはいかなるものもタグできません。

SV40以外の核移行シグナルでお勧めのものはありますでしょうか。
ネットで調べたところ、c-myc とか NF-κBp50　などがあるようですが、核移行シグナルとして十分機能するでしょうか（c-myc はタンパク精製用のタグで、核移行シグナルなのでしょうか？）

よろしくお願いします。
　
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No.597-7 - 2011/07/04 (月) 12:04:04 - おお
Large T antigenのNLSは700強のアミノ酸の長さのLarge T antigenの130番目のアミノ酸あたりに位置しています。また、c末、N末につけるケースがあり基本的に場所に依存していないといえます。ほかによくキャラクタらいずされたものではnucleoplasminなどがあるようですが、一般のプラスミドにはこれを使ったのは見たことがありません。ちなみにmycタグに使われるはいれつはNLSとは関係ないとおもいます。

いずれにしろスペーサーなどで十分距離をとり、露出した状況にするのがいいと思われます。

(無題) 削除/引用
No.597-5 - 2011/07/01 (金) 11:45:06 - ats
NLS-EGFPの例なら
http://bccm.belspo.be/db/lmbp_plasmid_details.php?NM=pEGFP-NLS

ありがとうございます。でも追加質問。 削除/引用
No.597-4 - 2011/06/30 (木) 20:30:58 - Toronton
ats さん。
実は今はGFP−目的タンパクという、SV40でタグしていないコンストラクトを使っているのですが、それではGFPは十分明るく見えます。ご指摘のように、SV40とGFPの間に全くアンカー配列を入れず、直接つなげてしまったからGFPがコンフォメーション変化を起こした可能性もあると、思いつきました。その場合、どんな配列をSV４０とGFPの間に入れればいいのでしょうか（すみません初心者なもので）。

ああさん。
GFP-NLS-目的タンパクという配列にした場合、NLSは何を使ったらよいのでしょうか。SV４０はタンパクのCあるいはN末に無くてもNLSとして機能しますでしょうか。
RFPも検討しましたが、一連の実験をGFP−目的タンパクという、SV４０なしのコンストラクトで初めてかなりのデータを取ってしまったので、今からRFPなどへタグの変更というのも厳しいのです。

(無題) 削除/引用
No.597-3 - 2011/06/30 (木) 15:39:08 - おお
局在がかわって局所的濃度に差ができ弱くみえるってことはないですか。
GFP-NSL-あなたのタンパクと言うのは可能でしょうか。
GFPの代わりにRFPとかちょっと違う分子種を使うのもてかと。。。

(無題) 削除/引用
No.597-2 - 2011/06/30 (木) 15:04:34 - ats
SV40NLS-GFPでもGFP-SV40NLSでも問題なく機能しますので、SV40のNLSに問題があるというより、SV40NLS-1-GFP-2-目的タンパクのつなぎ目2が短すぎるため、目的タンパクの立体構造がGFPの立体構造と干渉するのではないでしょうか。
GFPのバリアントには多量体化するものがあるので（というか４量体が天然）、気をつけてください。
EGFPは単量体です。

核移行シグナルの選択 削除/引用
No.597-1 - 2011/06/30 (木) 03:25:27 - Toronton
現在実験で使っているタンパクに核移行シグナルを付加してみました。
もともとのタンパクのN末にGFPを付加したのですが、さらにそのN末にSV40をタグしたところ（すなわちSV40−GFP-目的タンパクという配列）、GFPのコンフォメーションに影響を及ぼすらしく、タンパク発現量に比べてGFPのシグナルが非常に弱くなってしまいました。
このタンパクの性質上、C末にはいかなるものもタグできません。

SV40以外の核移行シグナルでお勧めのものはありますでしょうか。
ネットで調べたところ、c-myc とか NF-κBp50　などがあるようですが、核移行シグナルとして十分機能するでしょうか（c-myc はタンパク精製用のタグで、核移行シグナルなのでしょうか？）

よろしくお願いします。
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