BioTechnicalフォーラム [マウスＩｇＭ/ＳＤＳ

マウスＩｇＭ/ＳＤＳ－ＰＡＧＥ

No.588-TOPIC - 2011/06/28 (火) 17:21:55 - ＲＵＭＩ

マウスＩｇＭをＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認しようとしています。

わたしが調べたところ、マウスＩｇＭは９００ｋＤａですが、還元し電気泳動すると８０ｋＤａのバンドが確認できるとありましたが、バンドが確認できません。

なにかアドバイスがございましたらよろしくお願いいたします。

還元にはβーＭＥ，熱処理は１００℃、３分で行っております。
　

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No.588-11 - 2011/07/02 (土) 00:46:16 - おお

血清中にもIgMがあるんだからはなしにならないですね。もちろん発現量が非常に多ければ分かるでしょうけど、ハイぶりドーまからえられる抗体はそんなに多くはないですね、一般的に。あと血清の抗体がひっかからないようなウエスタン用の抗体を使わないと訳分からなくなりますのであしからず。
ELISAというてもありますね。

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No.588-10 - 2011/07/01 (金) 23:52:57 - ABZO

それはゲル染めても分かんないと思う。牛の血清タンパク質もいっぱいある訳だし、かりに80Kあたりになんか見えてもそれがIgM-Hなのかどうかは分からないし。ウェスタンして抗IgM抗体で検出してみないことにはこれはもう。

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No.588-9 - 2011/07/01 (金) 10:03:07 - えfw

>還元したＩｇＭでも抗ＩｇＭ抗体は認識できるのでしょうか？？

その抗IgM抗体がポリクロであれば大抵はいけます。

ありがとうございます

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No.588-8 - 2011/06/30 (木) 16:04:04 - ＲＵＭＩ

知らないことばかりで、とても勉強になりました。

ウエスタンで確認しようと思います。

そこでまたお聞きしたいのですが、
ＩｇＭは分子量が大きく還元しないとアクリルアミドゲルに入っていかないと聞いたことがあります。そして還元したＩｇＭは８０ｋＤａにバンドが確認できると聞いたのですが、、
還元したＩｇＭでも抗ＩｇＭ抗体は認識できるのでしょうか？？

よろしくお願いいたします。

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No.588-7 - 2011/06/29 (水) 21:39:05 - 名無し

血清培地中のIgMはSDS-PAGEでは確認できないと思います。
in situさんの言われるようにWesternで見るか、
どうしてもSDS-PAGEで見たければ精製した方がいいと思います。

(無題)

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No.588-6 - 2011/06/29 (水) 11:24:48 - in situ

血清が添加されているのであれば、IgMの相対量は（アルブミンなどに比べて）非常に少ないので、CBB染色で見えなくてもおかしくないと思います。

参考：血清蛋白質の成分ピーク図
http://www.one.ne.jp/yamagami/ichi/kesseipr.htm

というより、その実験系は指導教官か上司からの指示でしょうか？

銀染色で感度を上げれば、その辺りにバンドが見えるかもしれませんが、それがIgMであると断定できないと思います。

通常なら、抗IgM抗体を使ってウエスタンブロットで検出すると思うのですが。

(無題)

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No.588-5 - 2011/06/29 (水) 10:19:57 - ＲＵＭＩ

染色はＣＢＢで行っています。

情報の追加です

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No.588-4 - 2011/06/29 (水) 10:17:41 - ＲＵＭＩ

ハイブリドーマに産生させたＩｇＭです。
細胞培養の培地にはウシ血清が添加されています。

血清成分などのバンドはいろいろな位置に確認できるのですが、目的の８０ｋＤａの位置にバンドが確認できないといった状態です。

よろしくお願いいたします。

(無題)

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No.588-3 - 2011/06/28 (火) 22:54:26 - in situ

一体どのようなサンプルを泳動したのでしょうか？
血清？精製IgM？
また、どのようにして検出したのでしょうか？
CBB？銀染色？

このあたりの情報がないと、答えられる人がいないと思います。