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(無題) 削除/引用 No.586-8 - 2011/06/28 (火) 11:24:13 - marina >[Re:7] AAさんは書きました : > 青白判定のできるプラスミドを用いてクローニングをされた経験はありますか？ はい。pBluescript SK(-)というベクターを使用した経験があります。 > たとえ異なる制限酵素断端にしてあっても、青いコロニーが生えて来ないことの方が珍しいです。 > これがプラスミドが閉じただけのセルフライゲーションなのか、LacZに影響しない程度の何らかの短い断片が挿入されているのかはわかりませんが・・・ そうですね。 正直このセレクションも確かな信憑性があるわけではないらしいです。 > あと、環状のプラスミドを泳動すると一般的にバンドは複数見えますがライゲーション後の場合はどうなんでしょうね？ そこは、本当に気になりますね。 学生実験の頃に制限酵素でワンカットしたベクター（サイトが二つある）をligationし泳動で確認すると様々なバンドが見られたことはありました。 しかし、ダブルダイゼーションした場合は経験がないので分かりません。

(無題) 削除/引用 No.586-7 - 2011/06/28 (火) 11:12:26 - AA 青白判定のできるプラスミドを用いてクローニングをされた経験はありますか？ たとえ異なる制限酵素断端にしてあっても、青いコロニーが生えて来ないことの方が珍しいです。 これがプラスミドが閉じただけのセルフライゲーションなのか、LacZに影響しない程度の何らかの短い断片が挿入されているのかはわかりませんが・・・ あと、環状のプラスミドを泳動すると一般的にバンドは複数見えますがライゲーション後の場合はどうなんでしょうね？

(無題) 削除/引用 No.586-6 - 2011/06/28 (火) 11:07:01 - marina > #1で書かれているのは実際にあったことですよね。 はい、実際にあったことです。 > ライゲーションで自分が欲しい産物以外が生じるというのは実際あることです。 しかし、insertを含まないNCのサンプルと同じ位置にバンドがあるのは少々おかしな話ですよね。それに、もし成功していたとしてもocDNAとcccDNAが見えてもおかしくないはずです。しかし、今回の結果では、若干下のバンドが濃く見えるくらいでした。つまり、環状のベクターを有していないということなんですかね。 そうですね。 今後の展開として、具体的に何が起こっているのかを突き止めてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.586-5 - 2011/06/28 (火) 10:37:26 - ~ >このような結果が得られることは実際あるのでしょうか。 #1で書かれているのは実際にあったことですよね。 ライゲーションで自分が欲しい産物以外が生じるというのは実際あることです。 >このような結果が出てしまったからには原因を追究したいと思っています。 追求したいのであれば、9kb、12kbをそれぞれ切り出して、制限酵素マップで何ものなのかが確認できるでしょう。 �@9kb：ベクターの両端に別々のPCR産物が付いている、12kb：当たり �A9kb：当たり、12kb：ベクターの2量体 など、結論が出せるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.586-4 - 2011/06/28 (火) 09:23:44 - marina 追記 > まだトランスフォーメーション前の、ライゲーション直後の段階の話ですよね。 直後の段階です。

(無題) 削除/引用 No.586-3 - 2011/06/28 (火) 09:22:12 - marina ~san 確かにその通りです。 しかし、このような結果が出てしまったからには原因を追究したいと思っています。 今回、ligation後のサンプルを電気泳動したのは初めてだったため詳しい予備知識がありませんが、このような結果が得られることは実際あるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.586-2 - 2011/06/28 (火) 09:05:45 - ~ まだトランスフォーメーション前の、ライゲーション直後の段階の話ですよね。 また、目的はセルフライゲーションを（エチブロ？）染色レベルで検出限界以下にすることではなく、求めているコンストラクトを得ることですよね。 大腸菌に入れて複数クローンをミニプレップして制限酵素でチェックし、当たりを取ればいいのではないでしょうか。 そこで取れてくるのが全てセルフライゲーションだった場合に、改めて条件を考えてはいかがでしょうか。

セルフライゲーションに二つのバンド 削除/引用 No.586-1 - 2011/06/28 (火) 08:56:27 - marina 私は、制限酵素処理をしたベクターにPCR産物を導入することを試みています。 PCR product(1000bp) PCRは制限酵素サイトEcoR�T,Xba�Tを付加した（余分な配列はBio-Radのテキストを参照）状態で増幅し、フェノール処理・エタノール沈殿後に制限酵素で切断しPCR purification kit（100bp以下は落ちる）で酵素処理した断片を除き目的の配列のみを抽出しました。制限酵素のbufferはNEB Buffer3(2が在庫切れ)を使用し、37℃2時間で反応させました。 制限酵素処理後の余分配列を確認したわけではなので分かりませんが、一応最終段階までサンプルが存在したことを泳動で確認しました。 ベクター(7200bp) ベクターは制限酵素EcoR�T,Xba�Tで処理してゲルから抽出しました。 モル比1:3でligation high ver2をDNAの半量 insertを含まないself ligation（制限酵素処理後のベクターのみ） 16℃　30minで反応 1%アガロース電気泳動にて確認 まず、insertを含むligationにおいてバンドがくっきいりと3つだけありました。一つは、未反応のPCR product、もう二つは9000bp付近と12000bp付近でした。無事にligationが綺麗にいったと考えたのですが、問題がひとつありました。 それは、この二つのバンドがselif ligationにも似たようなところに（self ligationは少し下に出ている？）見えていたからです。通常、ベクター側が2個所の制限酵素で切断されればself ligationは起きにくい。起きたとしても、倍の塩基対数になるはずですよね。また、こちらではinsertのバンドは確認されませんでした。 これは、DNAがコンタミしているということでしょうか？

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