私は、制限酵素処理をしたベクターにPCR産物を導入することを試みています。
PCR product(1000bp)
PCRは制限酵素サイトEcoRT,XbaTを付加した（余分な配列はBio-Radのテキストを参照）状態で増幅し、フェノール処理・エタノール沈殿後に制限酵素で切断しPCR purification kit（100bp以下は落ちる）で酵素処理した断片を除き目的の配列のみを抽出しました。制限酵素のbufferはNEB Buffer3(2が在庫切れ)を使用し、37℃2時間で反応させました。
制限酵素処理後の余分配列を確認したわけではなので分かりませんが、一応最終段階までサンプルが存在したことを泳動で確認しました。
ベクター(7200bp)
ベクターは制限酵素EcoRT,XbaTで処理してゲルから抽出しました。
モル比1:3でligation high ver2をDNAの半量
insertを含まないself ligation（制限酵素処理後のベクターのみ）
16℃ 30minで反応
1%アガロース電気泳動にて確認
まず、insertを含むligationにおいてバンドがくっきいりと3つだけありました。一つは、未反応のPCR product、もう二つは9000bp付近と12000bp付近でした。無事にligationが綺麗にいったと考えたのですが、問題がひとつありました。
それは、この二つのバンドがselif ligationにも似たようなところに（self ligationは少し下に出ている？）見えていたからです。通常、ベクター側が2個所の制限酵素で切断されればself ligationは起きにくい。起きたとしても、倍の塩基対数になるはずですよね。また、こちらではinsertのバンドは確認されませんでした。
これは、DNAがコンタミしているということでしょうか？
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