トピック被っていたらすみません。
現在、免疫染色のためマウスの回腸・結腸の凍結切片の作製をしていますが、中々上手くできません。
基本プロトコルは以下のとおりです。
4%パラホルムアルデヒドを左心室から灌流し固定
↓
回腸、結腸を5_ほど切り出し、パラホルムアルデヒドに浸漬（24ｈ）
↓
管を切り開き、シートにしてからPBS洗浄
↓
コンパウンドに良くなじませた後、-80℃で凍結
↓
クリオスタットで薄切（10μm厚）
手足の痙攣と脱血を確認しているので、灌流は成功している筈です。
灌流せずに直ぐにパラホルムアルデヒドに浸漬することもあります。
症状としては、
１、細胞質が抜ける。
２、絨毛が痩せる。
の2つです。
細胞質の抜けは灌流しなかったときに良く見られます。薄切後、乾燥に伴ってプチプチと細胞質が消えていって（はじけて消えていくように見えます）、最終的にはスカスカのスポンジみたいな組織が残ります。DAPI染色すると細胞膜部分に蛍光がでるので、細胞質が寄ってしまっているものと思われます。
２、の絨毛の痩せは灌流時に顕著です。上手く説明できないのですが、絨毛が細く少なくなり、組織全体が縮こまっているようなイメージです。ムチムチした素敵な絨毛の見本からは程遠い組織切片ができます。
長くなってしまい申し訳ありませんが、同様の症状の方、その解決策に心当たりのある方は是非ご教授下さい。宜しくお願いします。 |
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