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ありがとうございました 削除/引用 No.574-6 - 2011/06/24 (金) 17:27:25 - nagai みなさま、力強い助言をありがとうございました。 具体的な数字がとても参考になります。 新鮮なケミカルコンピで再試行、だめなら再送付依頼の方向で進めたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.574-5 - 2011/06/24 (金) 16:53:41 - ~ ケミカルで入るとは思いますが。 >エレクトロポレーションは装置がラボに無いため 近所のラボにあるのでしたら、借りてはいかがでしょうか。 プレートに塗る抗生物質は間違えていませんよね。 サイズがそこそこ大きいので、半分くらいの濃度に薄めたプレートも作ってもいいかもしれません。BACだと、半分の濃度にすることがありますので、セレクションはかかるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.574-4 - 2011/06/24 (金) 16:37:01 - AP 23 kb程度のプラスミドなら（3 kbベクターにたかだか20 kbのインサートでしょう）、形質転換も精製も普通でいいはずです。サイズは大きくてもpUCだからコピー数は多いはずなので、コピー数の少ないBACの精製なんかより楽です。ただ、コンカテマーが生じやすくて、泳動像がいつもと違うことがあるかもしれませんが、それが問題になることはないと思います。 20 kb程度のプラスミドなら、10 kb以下のものと比べて一桁程度しか形質転換効率（cfu/ug)は落ちないはずですから、形質転換体を得るのはそう難しくないはず。それが取れないのは、コンピが劣化しているからかも。コンピを新規購入するか自分で作ってやり直しては。

(無題) 削除/引用 No.574-3 - 2011/06/24 (金) 16:30:52 - おお 通常のプラスミドのあつかいで大抵は大丈夫です。トランスフォーメーションもまあ1オーダー効率が落ちたとしてもケミカルでも楽勝でコロニーが得られるはずです。 もらったプラスミドなら送ってもらったところにいちど注意点などないか聞いて確認したらいいとおもいます。送られてきた状態があまりよくないということもあり得ますので、コミュニケーションを取っておいた方がいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.574-2 - 2011/06/24 (金) 15:57:45 - Ｃ２４ 普通に形質転換できるはずですが、、、pUC19での10^8は並行した実験で確認済みですか？

23kbプラスミドの増幅 削除/引用 No.574-1 - 2011/06/24 (金) 15:44:06 - nagai 23kb長のプラスミド（1ng/マイクロリットル）を譲渡していただきました。 pUC19をベースに、長大なプロモーター配列とLacZが載っています。 このプラスミドを増幅したいのですが、どのようにしたら良いでしょうか。 ケミカルコンピテント細胞DH5a（TOYOBO, 10^8）を一度試みましたが、コロニーが得られませんでした。エレクトロポレーションは装置がラボに無いため未試行です。また、形質転換ができたとして、抽出にどのような方法を用いるのが適切でしょうか。作製元のラボへの問い合わせはボスに頼んでおりますが、よい返答がありません。 オリジナルのプラスミドに限りがありますので、試行錯誤する前にお知恵をいただきたく思います。よろしくお願いします。

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