全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.572-9 - 2011/06/26 (日) 03:55:43 - おお >FLAGタグを付けて32kDくらいになる予定の分子が、44kD辺りに見えました。 これくらいならタグの影響であり得るかもしれないとおもいますが、、、32とかそもそもどのようにして割り出したんでしょうか? エンドのSDSPAGEであなたの電気えいどうのシステムで32とでるのでしょうか。エンドも電気えいどうすると40あたりに検出される ということはありませんか? そのフラッグを他の分子につけたからといって多分解決しないとおもいます。動き方は分子によってまちまちです。気になるなら違うタグも使ってみればいいかと思いますが、並行して同じ結果が出るようなら(タグなしとの比較でもいいです)FLAGは問題なく使えるという結論になると思います。

ありがとうございます 削除/引用 No.572-8 - 2011/06/26 (日) 00:37:25 - シビオ 皆さんのご意見大変参考になりました。 FLAGタグを付けて32kDくらいになる予定の分子が、44kD辺りに見えました。同じFLAGタグを付けた別の分子がありますので、この分子のサイズも確認してみようと思います。タグを変えてみるというのも場合によっては必要かもしれませんね。何かわかりましたらご報告させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.572-7 - 2011/06/25 (土) 14:07:24 - おお たいてい幾らか大きく出ると思います。どれ暗い大きく出るかはケースバイケースです。Dがついているので負電荷が増え移動度が大きくなるような印象もあるかもしれませんが実際アミノ酸バックボーンにSDSがついた場合の電荷総量です。負電荷のアミノ酸があるとSDSもつきにくくなる可能性がありますのでそれを移動度になるわけですが、それも予測がつきにくいでしょう。下流の配列とかも関係してくるので。 プラスミドの配列を読んでいて間違えがないのなら、FLAGで検出されるということであれば、設計通りのMで始まってちゃんと発現していると思います(N末のたぐならとくに)。どれくらい差があるかで判断が変わる可能性がありますが、余程ちがいすぎるなら(50kDaー>100kDaとか)修飾なども疑った方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.572-6 - 2011/06/25 (土) 13:51:06 - おお >ご存知の通りＦＬＡＧは正電荷のアミノ酸ばかりです。 D has a negative charge.

(無題) 削除/引用 No.572-5 - 2011/06/25 (土) 11:37:44 - 理屈上は DYKDDDDKでしたら、合計−３でマイナスですね。 でしたら、理屈上はわずかに増えた大きさと差し引きであまり変わらない感じがします。 私は、２個のFLAGでもあまり変わる経験はありません。少しだけ大きくみえていた記憶があります。 ただ、蛋白分子内で流しているときに、蛋白とFLAGの間に予想外の相互作用があると結果がかわるでしょう。 追求したい、しなければいけないなら、ほかのタグに変えるとか思いつきますが、面倒ですね。

(無題) 削除/引用 No.572-4 - 2011/06/25 (土) 11:05:20 - み FLAGを付けると大きめに出るのでしょうか？ 内在性の蛋白サイズも推定より大きめに出ませんか？

(無題) 削除/引用 No.572-3 - 2011/06/24 (金) 23:04:37 - Harmonia ウエスタンの結果があるけど、 http://dna.brc.riken.jp/en/RDB5956_2en.html 結構違いが出ます。

(無題) 削除/引用 No.572-2 - 2011/06/24 (金) 19:36:35 - FL 質問者さんが言う「遥かに大きいと」いうのが数kDaなのかわかりませんが。 もしそれが数十kDaなのであれば、以下は無視してください。 ご存知の通りＦＬＡＧは正電荷のアミノ酸ばかりです。 SDS-PAGEは負電荷にしたものをより早く移動させるので、正電荷が多いタンパク質はその分わずかに遅く移動することになります。 なので見かけ上、数kDa大きく見えます。 そもそもマーカーとして用いているものもタンパク質なので、タンパク質により正電荷・負電荷のアミノ酸数が違うため、同じkDaでも電荷により多少違いがでます。

FLAGタグを付けた蛋白のSDS-PAGE上の移動度 削除/引用 No.572-1 - 2011/06/24 (金) 13:50:01 - シビオ FLAGタグ（DYKDDDDK）をN末端に付けた蛋白をほ乳類細胞に発現させ、SDS-PAGE後抗FLAG抗体（シグマM２）でイムノブロットしました。 予想した分子サイズより遥かに大きいのですが、そのような経験をされたことがある方はいらっしゃいますか。 タグの上流40bpにはin flameにストップコドンがあり、タグとそのストップコドンの間に開始コドンはありません。なお塩基配列は確認しております。

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---