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(無題) 削除/引用 No.571-8 - 2011/06/27 (月) 23:10:27 - AP >今使っているのはAPです。 >ルミノールに変えて試してみたいとも思ったのですが、 >一次抗体が同じだったりするとあまり2つのやり方に >違いは出ないのでしょうか・・・？ APで出ないものがPOに変えただけで検出できるようになるとは考えにくいです。 逆ならあるかもしれませんが（APの方がPOより反応速度が遅いが寿命が長いので総ターンオーバーが一桁くらい高い）。また、APの発光検出の基質で最近メジャーなのはCSPDとCDP-Starだと思いますが、後者のほうが発光寿命が長く発光強度やS/Nも高かったと記憶します（前者だとオーバーナイトなど長時間の露光はあまり良い結果にならない）。 >CDKが検出されそうな位置にバンドが1本、 >絶対CDKじゃない位置にバンドが2本、 交差反応で標的でないタンパク質が検出されるということはよくあることです。また、AP検出の場合、サンプル中のフォスファターゼによってバンドが出ることがあるということに注意する必要があります。いずれにしろ、適当なコントロール（ネガティブコントロール）をとる必要があります（一次抗体を正常血清にする、一次抗体や二次抗体をスキップするなど）。 よい結果を得るためには、特に一次抗体の濃度を至適化するのがいいと思いますが、抗体に限りがあるときはABC kitなどで増感する方法もあります（結構高価ですが）。

(無題) 削除/引用 No.571-7 - 2011/06/27 (月) 17:54:45 - FL > しかし逆に、抗体濃度をあげるのでなく、ブロッキング時の > スキムミルク濃度を薄めにするというのは > あまりやらないほうがいいでしょうか？ 抗体にもよると思いますが、 5%スキムミルクかを3%BSAに変えたところ、バックも多少あがりますが、感度もかなりよくなりました。 バックが少なく、目的バンド付近に非特異的シグナルがないのであれば、試してみてもよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.571-6 - 2011/06/27 (月) 16:38:30 - おお >[Re:5] Kさんは書きました : > 皆さん詳しい回答ありがとうございます。 > 今使っているのはAPです。 > ルミノールに変えて試してみたいとも思ったのですが、 > 一次抗体が同じだったりするとあまり2つのやり方に > 違いは出ないのでしょうか・・・？ 違いは経験的には分かりませんが、APのほうが総合的にみて感度がいいです(長期間露光できるというのもあるからだと思います)。APの2次抗体が弱ってたりしたならHRPに変えた時しっかりとバンドが検出できるという、結果よければ。。。的なことも起こるかもしれませんけど。 ちなみにAPであればPBSTなど燐酸系のバッファーが使えませんけどTBSTをお使いでしょうか。同時に2次抗体-AP、の検出系がちゃんとワークしている根拠はありますか?それが働いてなければ1次抗体以外のところに問題があるわけで、抗体の濃度をいじっても解決にならないと思います。 > > サンプルはライセート(？)したものだけでなく > 濃縮したものもアプライしましたが > 結果はあまり変わりませんでした。 濃縮したサンプルがオーバーロードになってないとした場合は結果が変わらないのは何か変だと思いませんか?特異的なバンドを拾っていれば濃縮すればバンドは強くなるはず。また10倍も濃縮して乗せれませんでしょうから、濃縮して検出限界を上回るということはあまり期待できないのではないでしょうか? 加えて濃縮した時に方法によってはターゲットはロスしてるかもしれませんし結局どこがうまくいってないんだか分からない可能性はないでしょうか? > > 教授が嫌がりますが、今度は1次抗体の濃度を上げて > やってみようと思っています。 > しかし逆に、抗体濃度をあげるのでなく、ブロッキング時の > スキムミルク濃度を薄めにするというのは > あまりやらないほうがいいでしょうか？ ブロッキングは非特異を抑えるわけで特異的相互作用にはあまり関係ないはずです。特にタンパク性のブロッキング剤なら下げてもバックを上げてしまうだけではないでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.571-5 - 2011/06/27 (月) 14:44:13 - K 皆さん詳しい回答ありがとうございます。 今使っているのはAPです。 ルミノールに変えて試してみたいとも思ったのですが、 一次抗体が同じだったりするとあまり2つのやり方に 違いは出ないのでしょうか・・・？ サンプルはライセート(？)したものだけでなく 濃縮したものもアプライしましたが 結果はあまり変わりませんでした。 教授が嫌がりますが、今度は1次抗体の濃度を上げて やってみようと思っています。 しかし逆に、抗体濃度をあげるのでなく、ブロッキング時の スキムミルク濃度を薄めにするというのは あまりやらないほうがいいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.571-4 - 2011/06/25 (土) 17:16:44 - ABZO O/Nの露光は自分の周りではあんまり聞かないけど。長くてもせいぜい15~30分が限度という感じだけどな。それで駄目ならあきらめて、アプライ量増やす、抗体希釈率変える、反応時間や温度変える、あらかじめ細胞分画とかして特定画分に見たいものを濃縮する、抗体買い変える、などで再度トライするけどな。いつまでもイクスポーズしてればそれは何かそれらしいものも出てくるかもしれないけど、本物かなのか、よくわかんないnonspecificなものか区別難しいし、量の多いタンパク質とかなんかそれっぽくみえてくることあるし。

(無題) 削除/引用 No.571-3 - 2011/06/24 (金) 14:45:08 - おお 全く比較できるものではないのですが、CDK2、4、6は細胞からのらいせーとで第一世代のルミノール-HRPのシステムで1分もあれば十分検出できていました。今のルミノールーHRPはまあ2-3分やってバンドがほとんど見えないなあと思ったらO/Nでやることもありますが、1時間くらいかなぁ実質光っているのはという感じです。ヒストンとか量的に考えて10秒ぐらいで検出できてもいいかもと思ってしまいますが、こればかりは抗体しだいなのでなんともいえませんが、ちょっと府に落ちません。 ノンスペは出る抗体も出ない抗体もありますので、ただノンスペが出たというのはあまり評価のしようがありません。

(無題) 削除/引用 No.571-2 - 2011/06/24 (金) 14:12:59 - AP 現像時間ではなくて露光（露出）時間ですね。 検出原理（RI or 酵素（PO or AP etc..)によっても違うし、同じ原理でも製品ごとの改変（酵素、基質など）によっても違います。まずは、使っている製品の取扱説明書を読みましょう。 RI標識なら当然ながら長期の露出に耐えますが、酵素標識では酵素の寿命のために、限界があります。 アルカリフォスファターゼ（AP)は寿命がかなり長いので、一晩、場合によっては数日程度まで露出が可能です。 ウェスタンブロットで主流の、パーオキシダーゼ（PO）/ルミノール系では、一般的に、APよりPOの初期反応速度が速い一方、POの寿命が短いので、短時間での露出が適しています。改良型の系で寿命を延ばしたという製品もありますが、本来、一時間以内に反応しきってしまうと思っていいでしょう。 標識酵素による反応速度は、はじめが速くて、時間がたつと、酵素の失活、基質濃度の低下などで速度が落ちます。一方、一様なバックグラウンドを生じる、非酵素的な基質の分解は、非常に遅いながらも長時間にわたって一定の速度で進みます。なので、長時間露出するとバックグラウンドがシグナルに追いついてきてS/Nが悪くなります。そういう意味で、サンプル量、抗体濃度、増感法などを工夫して、短時間の露光で検出できるようにするのが理想的です。

メンブレンの現像時間の基準は 削除/引用 No.571-1 - 2011/06/24 (金) 12:08:42 - K 大学の学部生でタンパク質を 始めて半年くらいの者です。 現在植物からとったタンパクをSDS-PAGEで 泳動後、PVDF膜に転写して分析しています。 そこでX線フィルムへの露光の時間なのですが、 オーバーナイトや2日間以上の露光って普通に あることなのですか？？ 私は検出できないからといって CDKとヒストンを分析していますが、 ヒストンは１時間程度で十分検出できました。 CDKは丸1日やってもうっすらバックグラウンドがでるくらいです。 CDKが検出されそうな位置にバンドが1本、 絶対CDKじゃない位置にバンドが2本、 3本のバンドは同じような色の濃さなので、どれもCDKでは ないと考えてよいのでしょうか？？ 露光時間と検出結果について 皆様のご意見をお願いします。

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