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(無題) 削除/引用 No.569-10 - 2011/06/28 (火) 02:37:24 - 310 ？？様、おお様 一本鎖の分離抽出でもエチブロを用いることが出来ることを、教えていただきありがとうございます。 おお様 >重量比で5倍位はいれているような感じです。 多分、私の場合バッファーの量が少なすぎるのかもしれません。次回は重量を計ってバッファー量を決めてみます。

(無題) 削除/引用 No.569-9 - 2011/06/27 (月) 01:03:40 - おお >[Re:7] 310さんは書きました : > おお様 > 変性ゲルをお使いということは、DNAは一本鎖ということでしょうか、その際お使いになっている染色試薬をお教えいただけないでしょうか？ > > お手数をかけ申し訳ありませんが、よろしくお願いいたします。 抽出したのはRNAです。変性ゲルは6M以上の尿素で一本鎖のRNAです。染色は32Pを取り込ませたものでそれを一度フィルムにコンタクトさせた場合、メチレンブルーで染色した場合があります。エチブロでも一度やった事がありますが、大きな違いはなかったようなきがします(詳細にデーターを取っていませんので)。 抽出のバッファーもいいかげんです。重量比で5倍位はいれているような感じです。

(無題) 削除/引用 No.569-8 - 2011/06/26 (日) 18:05:07 - ？？ 変性・非変性ゲル＆Mermaidで短鎖DNAを精製していたのはずいぶん昔ですが、染色剤は特に気にせずエチブロでした。

(無題) 削除/引用 No.569-7 - 2011/06/25 (土) 05:55:32 - 310 おお様、みどり様 ご教示いただき、感謝至極です。 プロトコールの流れは質問に書いたとおりで不自然な部分はないように見えますが、溶出液容量とゲルの体積の対比がOMEGA社では15：1、Mermaidでは2：1になっています。おお様、みどり様がどのくらいのゲルと溶出液量で溶出をされているか、お教えいただければ幸いです。重量比のほうが私には分かりやすいですが、容量比でもかまいませんし、大体の数字で大丈夫なのでよろしくお願いいたします。 おお様 変性ゲルをお使いということは、DNAは一本鎖ということでしょうか、その際お使いになっている染色試薬をお教えいただけないでしょうか？ お手数をかけ申し訳ありませんが、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.569-6 - 2011/06/25 (土) 05:01:45 - みどり わたしもおおさんと同様の意見です。 DNAもRNAもBuffer中で拡散させる方法で90%以上の回収率です。 印象としてはアガロースからkitを使って回収する場合よりも、回収効率は断然いいと思っています。 プロトコルに問題ありとみます。

(無題) 削除/引用 No.569-5 - 2011/06/25 (土) 04:37:29 - おお 数百ベースのRNAをアクリルアミドゲルからよく抽出しますが、回収率は可也高いとおもってます。特にゲルを砕くこともなく0.5M位の酢酸アンモニウムと0.1%SDS存在下で3時間ほど室温でシェイカーをつかって拡散を促進しているぐらいです。で溶液をピペットで回収し(ゲルを除くため)年のためフェのクロ、エタチンです。フェノクロはなくても大丈夫に思えますがゲル破片を除くというのもあるのでやってます。切出しの時のRNaseコンタミもきになりますから。ゲルは念のため凍結します。 なので拡散で(多分DNAでも)かなり回収できる印象がありますけど... あ、ゲルは変性ゲルなので尿素が入ってますね。。。 参考になるか分かりませんが思いつくことを書いてみました。

(無題) 削除/引用 No.569-4 - 2011/06/24 (金) 03:11:25 - 310 ??様 ご指摘頂きありがとうございます。 今回、Mermaidをゲル抽出後行う末端平滑化処理として購入し、OMEGA社のアクリルアミド抽出キットを別途購入していました。理由は回収率についての記載がOMEGA社のキットにはあり、ゲルからの溶出70%、カラムからの溶出80%以上でバンドとして見えたDNAの半分は回収できると考えたからです。 しかし、Mermaidのゲル溶出時のインキュベーションがOMEGA社より短いこともあり、予備実験の今回は両方試しました。Mermaidの場合TBEに弱いのでTBEを使ったゲルは5分以上蒸留水で洗うこととマニュアルに書いてあったため、染色後に蒸留水で10分洗浄と5分洗浄を行いました。 ゲル溶出後は遠心して上清をグラスパウダーと混ぜるのですが、何故か遠心後ゲルが上層、溶出用のHigh Salt Wash Bufferが下層になってしまい、止む無くOmega社のゲルを濾すカラムで溶出液を回収しました。結果は全くDNAが回収できないこととなりました。制限酵素後の精製では50％以上の回収をしていたところから、High Salt Wash Bufferでの溶出失敗だと思っております。カラム洗浄用の液体が干上がっていたところを見ると、High Salt Wash Bufferも蒸発濃縮されたかもしれないので、後で液量を確認しようと思っています。 AP様 お教えいただきありがとうございます。OMEGA社のキットのマニュアルでもDNAをプローブに使う場合は、フィルターで濾した液をそのまま使用できると記入されていました。ただPCRなどを行う際にはその後のカラム精製を行うようにと記載されていたため、次の末端平滑化＆＋A反応のためにカラム精製しました。マニュアル通り4時間65Cで溶出したのですが、途中の物理的振盪が不足したためか1割程度の回収率に留まりました。 ところで溶出前にゲルを凍結融解する手法もおみかけしましたが、どちらのマニュアルにもないため今回は見送りました。凍結融解をしてからゲルをつぶすと溶出しやすくなるそうなのですが、凍結融解しなかったのも今回の失敗の原因でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.569-3 - 2011/06/23 (木) 22:40:05 - AP ゲルから溶出した液をカラム（シリカマトリックス？）にかけて精製するというのは必要なんでしょうか。アクリルアミドゲルを用いた分離、溶出ならそれだけでかなり高度な精製になっていると思うんですが（たとえば合成オリゴヌクレオチドの精製で行われるように）。 溶出液をつぶしたゲルごと、遠心濾過用のフィルターカップで遠心して溶出液を回収するのはどうでしょうか。アガロースゲルでもやる方法ですが、アガロースの品質によっては不純物によって酵素反応を阻害する場合もあるようです。しかし、アクリルアミドゲルならその心配も少ないのでは。

(無題) 削除/引用 No.569-2 - 2011/06/23 (木) 21:55:32 - ？？ マーメイドキットでよいのでは？

ポリアクリルアミドからのDNA抽出 削除/引用 No.569-1 - 2011/06/23 (木) 21:20:25 - 310 制限酵素で切断した50bp前後の断片を39bpの断片とゲルを用いて分離し、その後抽出、精製しようとしていますが、回収率が10%程度で困っております。せめて50％位まで上げたいと思っております。手順は 1.バンドをゲルから切り出し、チューブ内でホモジェナイザーの頭を使って粒子用になるまですりつぶす。 2.溶出用バッファを加え65Cで4時間インキュベート、ハイブリダイゼーションインキュベータにも関わらずrotateするパーツが無い（モーターは動く）ので、数十分から1時間ごとVortexをしました。 3.カラムを使い、ゲルとの混合液からから溶出用バッファーのみを回収、カラム結合液を加え、カラムに吸着。 4.カラム洗浄、溶出。 溶出中のVortexは多すぎると、65Cに保たれている時間が少なくなるので、これ以上増やせるか分かりません。 今考えているのは、 1.rotateする器具を購入する。 2.電気溶出法に切り替える。 3.高濃度アガロースに切り替える。 ですが、どのような方法がよろしいでしょうか？普段のゲル切り出しはアガロースとキアゲンのカラムを使っていますが、今回はDNAのサイズが短いので、アガロースを使ってもQiagenのカラムは使えなさそうですが、どうでしょうか？

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