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皆様ありがとうございます。 削除/引用 No.565-17 - 2011/06/24 (金) 21:06:25 - 初心者 いくつか試してみました。 結論から申し上げますと、振盪では無く、パラフィルム上に静置が私のコンセプトに一番マッチしてそうです。 バックおよびノンスペが非常に低く抑えられ、綺麗な結果が得られました。 今後これで安定して結果が得られればこれで回して生きたいです。 パラフィルムをガラスに敷き、その上にメンブレンを設置して抗体液をこんもり盛る 方法が私にも簡単に出来てかつ、抗体量が少なくて(550ul/MiniGel6Lane)済みました。 パラフィルムの効果には驚きました。 123様にアドバイス頂きました「ラップを敷く」は、 私がやるとシワがよる、張り付き過ぎるなどで少しテクニックが要りそうなので敬遠しました。 そして舟を作って振盪は、液量が必要なので試していません。 パラフィルム静置で問題が出たときに解決策のひとつとして考えたいと思います。 ハイブリバッグはラボにないことと、液量の点から試していません。 ジッパー付きビニール袋は意外と液量が必要でした（最小のサイズで3ml）。 Milliporeによる迅速検出を試してみましたが、乾燥状態ではWetのときよりも大量の液量が必要でした。 また、私の手技のせいか、検出できませんでした。 また、一般的ではないようなので避けたいと思います。 toyo様のおっしゃっていたCanGetSignalですが、ホームページの使用例ではすごい威力ですね。 私のプロトコールではTBS-T（tween=0.1％）とブロックエース1/10で1万倍以上に希釈していますが、 今のところこれがよいみたいなのでまだ必要なさそうです。 抗体の使いまわしは非常に興味がありますが、上記の抗体希釈液がどれくらい持つのかが分からないので、要時調製で回したいです。 皆様にたくさんのレスを頂き、大変参考になり、感謝しております。 ここで一応解決とさせていただきたいと思います。 ~ 様、123様、toyo様、まっくろん様、TS様、neko様、AP様、kodamataro様、in situ様、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.565-16 - 2011/06/24 (金) 11:33:27 - in situ 自分は、抗体液をパラフィルムの上に垂らしてその上にメンブレンを裏返しに乗せています。 これだと抗体液が流れ出さないですし、抗体液量は6x8cmメンブレン当たり1ml程度で済みます。 今までムラなどは経験ありませんが、ただ、あまりタンパク質をメインでやっているラボでもないので、何か問題点ありましたらご指摘ください。

(無題) 削除/引用 No.565-15 - 2011/06/23 (木) 23:32:18 - 初心者 123様 ご回答ありがとうございます。 私の読み違いでラップの間に挟むのかと勘違いしていました。 私のラボは実験台が紙で覆われているのでガラス板で代用したいと思います。 ありがとうございます。

ご回答ありがとうございます。 削除/引用 No.565-13 - 2011/06/23 (木) 15:40:45 - 初心者 まっくろん様 丁寧な解説をありがとうございます。 ハイブリバッグは大きさが自由に調節できる点でジッパー付き袋よりも役に立ちそうですね。 ボスに問い合わせてみたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.565-12 - 2011/06/23 (木) 15:37:55 - 123 ラボとしてこれで回しているので、特に問題ないです。実験台はきれいである必要があります。13レーンで1ｍLなので6レーンなら500uLで行けます。

(無題) 削除/引用 No.565-11 - 2011/06/23 (木) 15:26:13 - まっくろん 　うちではハイブリバッグ（ハード；コスモバイオが取り扱ってます）を使ってます。 　　�@ハイブリバッグを任意の大きさに切って、�Aメンブレンをはさみ、�B抗体溶液を入れて、�C空気を抜いてシーラーで止める、といった感じです。 　おっしゃるジッパ付き袋がどういったものか分かりませんが、個人的な印象ではバッグが柔らかいと空気を抜くのが難しい（シワになってしまう）ので、固いものを使っています。

たくさんのご回答ありがとうございます。 削除/引用 No.565-10 - 2011/06/23 (木) 14:36:44 - 初心者 皆様、ご回答ありがとうございます。 短時間にたくさんのレスを頂いて感激しております。 パラフィルムの舟というのはイラストレイテッドタンパク編で見たことがあります。 汎用されているようですね。振盪が可能な容器の最小化を考えるとパラフィルムですね。 短冊も多いですね。toyo様の短冊＋箸箱には驚きました。 ただ私はリプロービングで省力化と試料の節約を図りたいので他の方法を検討させていただきたいです。 （見たいタンパクの分子量がある程度離れていれば検討しますが、ターゲットが30〜50kDaに多いので。） 123さまのおっしゃる、ラップに乗せる方法は溶液が漏れたりする心配は無いのでしょうか？ 一番に液量が少なくてすみそうなのがハイブリバッグのようですね。 最近調べていてハイブリバッグの存在を知ったのですが、ノーザンやウェスタンで用いられるものですよね？ 私のラボには見当たらなく、また使い方のコツも分からないのですが、 ジッパーつきの小さい袋はこれの代用になり得ますか？ neko様の方法も興味があります。湿潤箱に設置したガラスにパラフィルムを貼り付けて試してみたいと思います。 AP様のおっしゃるMilliporeの乾燥メソッドですが、リプローブが可能かが気になります。Milliporeの免疫検出ガイドブックがあるので試してみたいと思います。 メタノールでWetさせればStripping可能かなとは考えておりますが。 一次抗体の使いまわしの際の濃度ですが、ある程度の濃度を確保しないと保存できないですか？ 私は1stAbを10,000倍に希釈して使用しているのでその点が不安です。

(無題) 削除/引用 No.565-9 - 2011/06/23 (木) 14:22:21 - kodamataro 使用する１次抗体に最終濃度0.02%アザイドを加えて５回くらい使いまわしています。

(無題) 削除/引用 No.565-8 - 2011/06/23 (木) 13:51:28 - AP 過去にもなんどか話題に上がっていましたが、ミリポアが提唱している、PVDFのブロットを乾燥させてから抗体反応する方法はいかがでしょう。洗いを短縮できるなどをメリットとした迅速法として紹介されていますが、抗体反応のときに溶液を最小限にできるメリットもあります。 シャーレやパラフィルムの上に表面張力で載せた抗体液に、乾燥させたPVDFをブロット面を向けて載せます。PVDF膜は疎水性なので抗体液を吸わないので液量が節約できる上、表面張力で盛り上がった液の上に浮かんだ状態になるので、底に沈んで密着した状態のように液中の物資の自由拡散を妨げるということが起こりにくいと考えられます。 詳しいことはミリポアから、

(無題) 削除/引用 No.565-7 - 2011/06/23 (木) 13:20:28 - neko 　私のところでは透明の平たい蓋付きのプラスチックケース(30ｃｍｘ30ｃｍ　高さ2センチくらい）の底に少量の水をたらし、パラフィルムを大きく切って載せてこすって完全に密着させたものを使っています。(パラフィルムは一度しっかり貼り付ければはがれなくなりますので、取り替える必要はありません。ざっと洗って水分をふき取ればまた使えます。） メンブレンをそのパラフィルムの上に載せれば、抗体液を表面張力でこんもりと載せられます。ミニゲル１レーンあたり100μLから200μLの液量で済んでいます。

(無題) 削除/引用 No.565-6 - 2011/06/23 (木) 13:15:40 - TS 私は、パラフィルムで舟をつくっています。 なんとなくゆらゆら揺らすのが好きなので。 ミニゲルの短冊で２ｍLの抗体液を入れています。

(無題) 削除/引用 No.565-5 - 2011/06/23 (木) 12:31:53 - まっくろん 　うちはハイブリバッグ派です。 　Toyoさんもおっしゃっていますが、うちでも目的分子量あたりの短冊を作り、ハイブリバッグに入れて、インキュベートしています。ミニゲル１枚くらいなら1〜2ml（短冊ならももっと少なく）あれば、十分ではないでしょうか？ 　ただ空気を抜くなど多少コツがいるので、予備サンプルで検討した後、うまくいけば採用してみてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.565-4 - 2011/06/23 (木) 12:05:46 - toyo うちのラボでは、メンブレンを見たいバンドの高さに合わせて短冊状に切り、 100円均一で売っているプラスチック製の箸箱に入れて、シーソー型振盪器で 一晩反応させています。反応ムラも少なくなりますのでお勧めです。 箸箱がなければ、パラフィルムで船を作るという手もあります。 抗体溶液の必要量は箸箱の短軸方向の長さに依存しますが、3cm幅程度の 一般的なものであれば2〜3mlくらいで十分です。 容器が水をはじくので、抗体溶液は基本的にメンブレン上を移動しますから、 もっと少量でも乾燥を避けられるかもしれません。 抗体をケチるためにハイブリパックを使うこともあります。 抗体溶液の液量は箸箱よりも少なくて済みますが、 うちのラボではムラを気にして箸箱に乗り換えました。 あとはCan Get Signal等を利用するとかでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.565-3 - 2011/06/23 (木) 12:05:18 - 123 私はサランラップをまず実験台に張り付けて、ラップの上に抗体溶液をたらし、その上にメンブレンをかぶせると習いました。 30ｘ30cmぐらいにラップを切ってキムワイプで何回もなぞるときれいに実験台に張り付きます。

(無題) 削除/引用 No.565-2 - 2011/06/23 (木) 12:01:31 - ~ パラフィルムでメンブレンサイズの船を作って、その中で反応させているヒトはいます。 メンブレンサイズにあった枠が出来ますので、液量を最小にできることになります。 液量を減らしたいのであれば、湿潤箱の中にパラフィルムの船を入れて、振盪してみてはいかがでしょうか。 また、1次抗体であれば、使いまわせる場合もあります。 10回使えば、液量を10倍にしても同じコストになりますよね。 2次抗体を使いまわした時に、前のメンブレンについていた1次抗体がコンタミしたことがあったため、2次抗体は使いまわさないようにしています。 （同じ1次抗体の場合は使いまわすこともありますが）

Westernの抗体をケチりたい 削除/引用 No.565-1 - 2011/06/23 (木) 11:35:57 - 初心者 お世話になります。 ボスの方針でWesternにつかう抗体は節約しなくてはいけないことになっています。 そのため私のラボでは、湿潤した箱の中で水平を保ってメンブレンに抗体を乗せています。 この方法ではミニゲル6レーンで550uL程度の抗体溶液で足ります。 （さらに抗体濃度は10,000倍以上に希釈しているのでかなり節約できています） しかし、この方法に問題があり今回ここでアドバイスを頂きたいです。 その問題とは、いくら水平保っても抗体溶液がメンブレンの外に流れ出てしまうことです。 理想としては、メンブレンにこんもりと表面張力でそとにはみ出さないように静置したいところですが、うまく行きません。 そして、ノンスペおよびバックグラウンドが検出されてしまうことです。 非特異とはみ出すことが関係あるとは断言できませんが、 メンブレンの乾燥はwash不足からの非特異に結びつくというのが一般的だと思います。 さらに、同じ抗体を同じ条件で使用して非特異が検出される場合と綺麗な結果が得られるときがあるので、抗体に問題があるようには思えません。 ちなみにブロッキングにはブロックエースを使用しています。 このようなことから、抗体反応を静置ではなくて振盪にしようかと考えています。 振盪すれば、乾燥の心配も無く一定のクオリティーで抗体を反応できると考えるからです。 しかし、普通に振盪すると大量の液量が必要ですよね。 （メンブレンが入る小さめの容器でも10mlは必要かなといったところです） これを解決するいい方法をアドバイスしていただきたいです。 もしくは水平に静置するときの乾燥しないアドバイスでも歓迎いたします。 ご回答お待ちしております。よろしくお願いします。

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