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(無題) 削除/引用 No.563-7 - 2011/06/23 (木) 19:33:45 - 774 KODでPCR ↓ 反応終了後、その反応チューブに直接ExTaqを1/50vol入れる ↓ ７２℃１０分 ↓ ゲル抽 ↓ TAクローニング 効率落ちるけどまぁまぁいける。

(無題) 削除/引用 No.563-6 - 2011/06/23 (木) 11:29:26 - isu KODの取説にはフェノクロ→エタ沈とありますね。 また、TOYOBOのA-attachment Mixを使ったことがありますが 1ステップでKODの不活化とA付加ができて便利でした。 やや高価ですが。

(無題) 削除/引用 No.563-5 - 2011/06/23 (木) 10:45:01 - AP 蛇足ですが、各種酵素の失活条件（熱処理、EtOH ppt、PheOH抽出など）は、酵素カタログの付録等が参考になります。

(無題) 削除/引用 No.563-4 - 2011/06/23 (木) 10:37:21 - AP ごく普通の手技ですが、うまくいかない原因の可能性としては、 >KOD系のAが付加されない酵素でPCRをした後に、エタ沈で精製、 EtOH pptではPCR用酵素は失活せずキャリーオーバーして、一塩基付加された3'突出末端を再び平滑化してしまいます。失敗せずにやりたいならPheOH抽出など、除タンパク質操作をかませるべきです。

(無題) 削除/引用 No.563-3 - 2011/06/23 (木) 10:22:01 - fire 間違いです、すみません。 dNTPs、Mg、テンプレート、Taqは入れます。

(無題) 削除/引用 No.563-2 - 2011/06/23 (木) 09:36:43 - ~ >ExTaqでを入れないで 多分単語が抜けていると思いますが、何を入れないのでしょうか。 DNA polymeraseを入れますよ。 dNTPs(またはdATP)を入れますよ。 バッファーを入れますよ。 Aを付加したいDNAフラグメントも入れますよ。 エタ沈後に何かが残存していて、それで足りるものがあるのかもしれませんが、系を不安定にしてまで省略する必要はないでしょう。

TAクローニング 削除/引用 No.563-1 - 2011/06/23 (木) 09:05:28 - fire KOD系のAが付加されない酵素でPCRをした後に、エタ沈で精製、 それをテンプレートにTakaraのExTaqでを入れないで72℃、10分インキュベートすれば TAクローニングできるときいたのですが本当なのでしょうか？ 自分でやっていますが、ほとんど成功しないので

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