BioTechnicalフォーラム [アリル特異的PCR]

アリル特異的PCR

No.553-TOPIC - 2011/06/18 (土) 15:08:21 - AS-PCR

G>T変異をアリル特異的PCRで検出しようと試みています。プライマーの3'末端に変異部位が来るようにプライマーを設計して試みていますが、いくらアニーリング温度を上げても、タッチダウンを試みても、野生型と変異型の両方のゲノムでバンドが出てしまいます。プライマーの特異性を高めようと、３’末端から３番目の塩基に人為的なミスマッチを入れたりもしましたが、やっぱり野生型と変異型でバンドが検出されてしまいます。アニーリング温度を限界まで上げても、バンドが出なくなるアニーリング温度は野生型と変異型でほぼ同じでした。

GTGGTTCAAAT(G)

このように、野生型は.....AAAGで、変異型は....AAATとなります。変異部位ATがかたまるので、検出しにくいのでしょうか？

ネガティブコントロールにはバンドが出ないので、ゲノム溶液とプライマー溶液にコンタミは無いと思われます。

他に何かできる対策について、ご助言を頂けますようお願い致します。
　

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No.553-11 - 2011/06/22 (水) 04:23:02 - 310

TaqGoldは強力にプライマー配列3’ミスマッチに反応していたと思います。
普通のTaqなら、Taqの抗体でホットスタートをかける。オートクレーブしたパラフィンを仕切りに使い自動ホットスタートをかける。プライマーの量and/orアニーリング温度を増えるぎりぎりにする。作業を氷中で行い最初の変性温度まで上昇したPCRブロックに入れる（この際、変性時間は30秒ほど増やす。）

私の知り合いの先生は、故意にどちらのアリルでもアニールしない塩基を3’に加え不安定性を増してアリルPCRを成功させていました。ホットスタート無しでやってましたので、上記の方法と同時にやると全く増えないかもしれません。

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No.553-10 - 2011/06/20 (月) 19:10:57 - dcaps

JJさんの方法、dCAPSと言って、
http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html
で、簡単にプライマー設計が可能です。

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No.553-9 - 2011/06/20 (月) 17:06:56 - AS-PCR

様々なサジェスチョンを頂きましたこと、
皆様にお礼を申し上げます。

PCRにこだわらず、RFLPも視野に入れてやってみようと思います。
ありがとうございました。

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No.553-8 - 2011/06/19 (日) 11:36:55 - UC

AS-PCRに関しては、理論的にはOKのはずなのにうまく行かなかったりというのは多々ありますね。うまくいく領域はあっさりOKなのに。以前経験したものでは、自分が増やしていると思っている領域とは違うところに似た配列があって、実はそちらも増幅してましたなんてのがありました。AS-PCRに拘らなくても良いのなら、Taqman probeやInvader法によるSNP検出でも良いでしょうね。
経験から言えば、AS-PCRは上手くいかない領域は何をやってもダメという感じでJJさんみたいに他の手法との組み合わせになるのかと思っています。PCRで完結する何か良いアイデアがあるならぼくも知りたいです。

配列特異性の問題で、他の領域が邪魔をしている可能性があるのなら、増幅したい領域を含む部分だけを確実に増幅しておいて、それからnested PCRなども試してみても良いかもしれません。

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No.553-7 - 2011/06/19 (日) 02:40:08 - JJ

点変異を持つマウスのgenotypingをしています。mutant allele由来の増幅産物のみ制限酵素で切断されるようにプライマーに変異を入れて、PCR産物を切断後、高分解能のアガロースゲルでサイズの違いを検出しています。例えば、GTGGTTCAAAをGTG(A)TT(T)AAAに変更すると、T変異の場合のみSwaIで切断されます。変異部位より3'側の配列によっては、プライマーの変異が1箇所で済むような酵素も選択できるかもしれません。

G型/T型のヘテロの場合、計算上50%の産物はキメラになり制限酵素で切断されません。切断されるのは多くて25%、実際はそれ以下になりますので、明瞭に検出できるかどうかはやってみないとわかりません。

もしPCRの条件設定に苦労するようでしたら検討してください。

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No.553-6 - 2011/06/19 (日) 02:27:37 - 774

1塩基変異のマウスの遺伝子型判定にPCRをしています。
マウスを分与していただいた先生からは
「PCRの際にゲノムの濃度を20ng/ulにするように」
と指示されています。
100％うまくいっているかと聞かれると実はそうでもないのですが、おおよそうまくいっております。
自分で濃度をいくらか振ってみましたが確かにそのくらいがちょうど良いようでした。

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No.553-5 - 2011/06/18 (土) 23:30:21 - ops

リアルタイムPCRのプライマーの設計では、
3'末端がＴだと、ミスマッチでもプライミングしてしまう確率が高くなるらしいので避けるようにするみたいです。
TaKaRaのプライマー設計ガイドラインで知ったのですが・・・。
http://www.takara-bio.co.jp/prt/h1-3b.htm

この情報のオリジナルの論文（参考文献）がどれなのか分からず・・・。
（どなたか御存知ないでしょうかね？）

試しに、プライマーの方向が逆向きになるように、PCRの領域を設定して、
3'末端がAになるようにしてみてはいかがでしょうか。

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No.553-4 - 2011/06/18 (土) 22:27:49 - ンンノ

精製度の高いプライマーを作って、サイクル数を減らしてみる。

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No.553-3 - 2011/06/18 (土) 16:38:52 - AS-PCR

>酵素はなにをお使いで？
>校正活性の酵素だと、3'末端のミスマッチは削られて伸長が起こります。
コメントをありがとうございます。
校正活性の酵素ではなく、Taqを使用しています。

他の点変異を同じような戦略で検出したときには、特異的に検出できていたので、ポリメラーゼの影響ではないだろうと考えておりました。

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No.553-2 - 2011/06/18 (土) 16:32:48 - AP

酵素はなにをお使いで？
校正活性の酵素だと、3'末端のミスマッチは削られて伸長が起こります。

アリル特異的PCR

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No.553-1 - 2011/06/18 (土) 15:08:21 - AS-PCR

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