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皆様ご教授下さいましてありがとうございました。 削除/引用 No.551-18 - 2011/06/28 (火) 17:32:16 - To.To プラスミドを回収することができました。 教授が同様にトランスフォーメーションを行って（生えはやはり悪い）miniprepで抽出し、アガロース電気泳動で目的の位置にバンドが確認できました。 私と教授の違いは、私はプラスミドの上澄み？と明記すればよろしいのか分かりませんが、1.5ml tubeに1μlとしか入っていない状態で1μlとり希釈してトランスフォーメーションを行って私に対して、教授は乾いたtubeに新しく滅菌水を加えて行っておりました。 原因としては、乾燥してしまっていたためtransformateを取れていなかったらのではとのことです。 皆様、本当に有り難うございました。 教授にも大変感謝いたしております。

(無題) 削除/引用 No.551-17 - 2011/06/24 (金) 23:31:50 - Harmonia ちょこっとでも取れたプラスミドがあるなら、それをフェノール抽出して、再度、大腸菌で増やせば解決することがあります。 ファージのたぐいがコンタミしていると、キットのカラム精製では逃げ切れないので、ずっとお付き合いすることになる、と勝手に考えています。

(無題) 削除/引用 No.551-16 - 2011/06/21 (火) 00:29:01 - To.To おお様 ご指導有り難うございます。 私自身、こちらでのご助言や調べた限りですと一番原因として考えられるのは使用したコンピテントセルだと考えていました。以前使用していたたコンピテントセルとやはり異なっていました。よって、コンピテントセルとプラスミドの相性が要因だと考えております。また、おお様の仰るようにアンピシリン濃度やTB培地にて低温で培養するなど検討したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.551-15 - 2011/06/19 (日) 13:33:51 - おお いんタクトなプラスミドとトランスフォーメーションするにはさほど効率は関係ないようの思います。むかしはカルシウムをつかったルビジウムよりはるかに効率のわるいトランスフォーメーションをしていたようですし。毒性ということであれば温度を下げるのとアンピしリンの濃度を下げますね。もともと低コピー用ではどこまで有効か分かりかねますけど。あとは大腸菌をかえてみる(よく説明できないけどプラスミドによって相性があるばあいがある)。 えたチンはロスがほとんどない方法です。ペレットさえ見失なわなければ。PCR/DNA purificationキットもそんなにロスはないと思いますが、実際の効率は分かりませんサイズなどのも影響させれかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.551-14 - 2011/06/18 (土) 14:28:41 - To.To AP様 わざわざ、調べて頂きましてありがとうございました。 そうなると、TOP10で大丈夫との御話しだったのですが、導入する大腸菌を変えてみることを優先した方が良いかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.551-13 - 2011/06/18 (土) 13:57:44 - AP 調べてみたら、野生型のColE1 ori (pBR322 ori)のようですね。 http://www.lablife.org/p?a=vdb_view&id=g2.DqMRhrFBMZdxKJl9z0QJo82hJ5w- だとしたらもともと低コピーで、温度を下げてコピー数を減らすのは期待できないですね。

(無題) 削除/引用 No.551-12 - 2011/06/18 (土) 13:45:23 - To.To AP様 まさにその症状ですね。 確かにその可能性は高いかもしれません。lacオペレーターが付加してあるベクターではありませんし、毒素によって大腸菌が死滅しているのかもしれません。だとしたら、液体培養で上手く生えない理由にもなりますね。 仮にTB培地で培養する際は30℃くらいでよろしいのでしょうか。 さらに温度を低くすることで毒性を低くすることができるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.551-11 - 2011/06/18 (土) 13:31:53 - To.To ああああ様 度々申し訳ありません。 先程、pVL1393のベクターマップを改めて拝見したのですがpUC oriの記載がないようなのですが、何bp付近にありますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.551-10 - 2011/06/18 (土) 13:23:32 - To.To 774様 確かにコンピテントセルの形質転換効率は非常に落ちています。 これは、作製してから一年間経っていることが原因だと考えています。 しかし、形質転換効率が落ちていたからといってあくまで導入する確立が減るだけであって、その後の生えたコロニーを接種した液体培養で生えにくいということはあるのでしょうか。 そうですね。 新しくプラスミドが取れましたら、必ず再度Transformationを行う予定です。

(無題) 削除/引用 No.551-9 - 2011/06/18 (土) 13:17:06 - To.To ops様 Ampの濃度は50-100ug/mlくらいのほうがいいとは思うのですが、10mlジャストでシャーレにLB寒天培地が入っているのかデカンとで入れているため分かりません。なので、当研究室ではAmpを後まきする際は200μg/mlで行っています。 そうですね。 LB培地200mlくらいで、1Lのフラスコを使って増やすことを視野に入れたいと思っています。 QIAGENのキットを用いております。 溶出はBuffer QF(pH 8.5) 15ml で行っていますが、最後のDNAを集めてフィルターで余分なモノを排除して溶出する操作で滅菌水1mlで溶出を行っております。 一応このkitではPCR産物やプラスミドを濃縮できると記載されています。 �A�Bの結果からおそらく抽出できる量は5~6μg程だと考えたのでエタ沈も考えましたkitを用いてみました。kitの方が収量も高いと見込んで。 申し訳ありません。記載ミスです。 QIAGENのキットのプロトコル通りP1:250ul, P2:250ulに対して、N3が３５０ulで行っています。

(無題) 削除/引用 No.551-8 - 2011/06/18 (土) 11:40:31 - AP コロニーの数が期待より少ない、育ちが悪い、あるいはコロニーをピックアップして液体培養すると、濁りが遅かったりまったく増えない、やっと増えたものからプラスミドを精製しても、おかしな物が取れてくるとか、まったく取れたように見えない、、 これらの症状は、プラスミドからleakyに発現が起こって、その産物が宿主にとって毒性の場合に典型的に見られることです。その線からも対策を考えるべきではないでしょうか。 TBなどリッチな培地を使うのはある程度、効果が期待できます。 培養温度を下げるのは有効かもしれません。pUC系のoriなら温度感受性で細胞あたりのコピー数が下がるので毒性産物の量も減ります。

(無題) 削除/引用 No.551-7 - 2011/06/18 (土) 10:36:58 - 774 もう一点だけ気になることが。 opsさんが指摘されてるように、コンピがダメになってる可能性があるような気がします。 To.Toさんの結果では効率がいい方でも6.3x10^4で、さすがに落ちすぎではないかと。

(無題) 削除/引用 No.551-6 - 2011/06/18 (土) 10:32:14 - 774 少ししか取れないプラスミドでも、新しく取れたプラスミドをtransformし直すと、取れるようになった経験があります。 理由は全くわかりません。

(無題) 削除/引用 No.551-5 - 2011/06/18 (土) 10:11:01 - ops pVL1393というベクターを使ったことは無いので、 的外れな事を言うかもしれませんが、気になったところを少し。 >使用するコンピテントセル:TOP10 1.0×10＾5 cfu/μg すこし効率が低いと思います。（まあ全量播種すればいいのでしょうが） プラスミドがが、ベクター内で組み換えを起こすようなら Stbl系やSURE系のセルに変えることも考えますが、 ちょっと今の段階では変えるべきかは分からないですね。 >使用する寒天培地:LB+Amp(final 約200μg/ml) Ampの濃度は50-100ug/mlくらいのほうがいいのでは。 >本培養 >LB+Amp(final 約100μg/ml) 50ml culture プラスミドを増やしにくい事があらかじめ分かっているなら、 LB培地200mlくらいで、1Lのフラスコを使って増やしたほうがいいかと思います。 >プラスミド抽出 >�@Maxi（新品）での精製　50ml culture >滅菌水1mlでelute 使っているのは、QIAGENのキットでしょうか？ 溶出は、プロトコールでは、Buffer QF(pH 8.5) 15ml だと思いますが、 滅菌水1mlで溶出できているのでしょうか？ >*濃度が低いことが予想されたため、PCR purification kitで濃縮 ちょっとやった事がないので、分からないのですが、 プラスミドをこのキットのカラムで濃縮できるのでしょうか？ たしか、QIAGENのこのキットのカラムの結合能は10ugだったと思いますが。 >�AMini prep（P1のみ新品で他は一昨年のもの）での精製　50ml culture >P1:5ml P2:5ml N3:5ml >�BMini prep（P1のみ新品で他は一昨年のもの）での精製　2ml culture >P1:250μl P2:250μl N3:250μl QIAGENのキットでしたら、 P1:250ul, P2:250ulに対して、N3が３５０ulだと思います。

(無題) 削除/引用 No.551-4 - 2011/06/18 (土) 09:22:27 - To.To ああああ様 おお様 大元のプラスミド1990年度作製が100ng/μlで0.5μlしかなかく、泳動には50ng分ほど使用してしまいますのでTransformationやその後の実験に失敗する恐れがあったため泳動では確認しておりません。出来れば、PCとして泳動したかったのですが。 high copyでしたか。調べ不足で申し訳ありません。 あまりにプラスミドが取れなかったことや菌の増えが悪かったことから低コピーだと考えてしまいました。 つまり、元のベクターに何か問題があるのでしょうか。しかし、教授が当時TB培地で増殖後にPEG沈で精製したベクター（私が現在使っているものと同じものか分かりかねますが）の泳動ではしっかりとcccDNAが見受けられました。また、スメアになっていませんでした。 当時の実験方法 TB 5mlで液体培養を行う。 TB 1.5mlを用いてプラスミド抽出（ABIプロトコル、PEG沈） DNA濃度 約100ng/μl なるほど。おお様の仰ることも考えられますね。 今後、そのプラスミドをPCRを用いて特定の配列を増幅させようと考えています。しかし、仮にcccDNAが泳動で見られなくてもスメアなバンド（引きずったような）が見られてもocDNAがあればPCRで増幅することは可能なのでしょうか。阻害される可能性はありますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.551-3 - 2011/06/18 (土) 06:38:06 - ああああ pVL1393はpUC oriだからhigh copyのはずです。 以前に使用したことがありますが、普通に取れてました。 transformationに使用している大元のplasmidの確認はしてますか？

(無題) 削除/引用 No.551-2 - 2011/06/18 (土) 01:58:56 - おお 得られたDNAは制限酵素で切るとどういうふうに見えますでしょうか?クローズドサーキュラーのDNAは比較的ぼやけて見えます。スーパーコイルの巻数により移動度がちがい、プラスミドによってもこのディストリビューションが違うようにおもえます。 いちどだけこんな経験がありました。あるプラスミドをセシクロで超遠心までもっていってスーパーコイルのプラスミドを精製したのですが一種類だけどうしてもかなりの範囲にわたってスメアーな電気えいどうになってしまいます。最初は何か失敗とおもったのですが、何度やってもそうなります。制限酵素できるとちゃんと理論通りのところにバンドがあらわれ、スメアーなバンドはなく分解はしてないのとオープンサーキュラーのバンドは確認できないか、無視できる程度だったので、そのプラスミドの配列特異的な構造とかスーパーコイルの巻数の分布が幅広いとかの理由で分解でないという考えに至りました。そのプラスミドはその状態で問題なくつかえました。

低コピーベクターのプラスミド抽出 削除/引用 No.551-1 - 2011/06/18 (土) 00:44:34 - To.To こちらのフォーラムでいくつか低コピーのプラスミド抽出に関するトピックを拝見させて頂いたのですが、私が抱えている問題が一致するのか判別できなかったためトピックを作成させて頂きました。 現在、低コピー品と思われる（実験結果及び教授の御話から参考）pVL1393という昆虫細胞発現用のベクターのMCSに目的のタンパク質である塩基配列を導入したプラスミドの精製を行っています。しかし、プラスミド抽出を行いagarose gelで泳動してみるとバンドがスメアでとても使用することができない状態にあります。 皆様のお知恵を御貸し頂けたら幸いです。 何卒よろしく願い致します。 実験方法 使用するvector:pVL1393 使用するコンピテントセル:TOP10 1.0×10＾5 cfu/μg ~Transformation~ DNA 10ng使用 使用する寒天培地:LB+Amp(final 約200μg/ml) 37℃ 18時間培養（コロニーが小さかったため、18時間培養した） コロニー数　23cfu（同時期で行った高コピーは1ngで63cfu） ~液体培養~ 前培養 LB+Amp(final 約100μg/ml) 2ml culture 37℃ 8時間培養 シングルコロニーを接種するが、3本中1本だけ濁った。 本培養 LB+Amp(final 約100μg/ml) 50ml culture 前培養液500μl加えて37℃16時間培養。 プラスミド抽出 �@Maxi（新品）での精製　50ml culture P1:10ml P2:10ml P3:10ml 滅菌水1mlでelute *濃度が低いことが予想されたため、PCR purification kitで濃縮 DNA濃度　26ng/μl アガロース電気泳動の結果では、OCDNAのバンドははっきりと検出されたがCCCDNAは検出されずバンドがスメアとなった。 �AMini prep（P1のみ新品で他は一昨年のもの）での精製　50ml culture P1:5ml P2:5ml N3:5ml (N3を入れた時点でデブリが細々と粒子のようだった) 50μlでelute DNA濃度 100ng/μl アガロース電気泳動の結果では、OC,CCCDNA両方とも確認できずバンドがスメアとなっていた。 �BMini prep（P1のみ新品で他は一昨年のもの）での精製　2ml culture P1:250μl P2:250μl N3:250μl (N3を入れた時点でデブリが細々と粒子のようだった) 50μlでelute DNA濃度 10ng/μl 以上が今までの実験方法と結果となります。 次の打開策としてKitを使わずにPEG沈を教授に進められておりますが、何が原因なのかはっきりしないまま次のステップに移るのは非常に不安です。 そもそも、Transformationや液体培養の時点でなかなか菌が生えてくれないのは低コピーが原因なのでしょうか。例えば、単に菌体を増やすならTB培地もしくは、前培養の段階でAmp濃度を少しだけ下げて本培養では今までの条件に合わせればセレクションをかけられると考えてよろしいのでしょうか。 お気づきの点がありましたらご教授のほどよろしく願い致します。

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