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(無題) 削除/引用 No.547-12 - 2011/06/22 (水) 08:08:42 - seq シークエンスの外注はかなり安くなっていて、反応あたり$10もかかりません。 結果も数日ででるし、安いとこなら$5を切るのでは。 大きな大学や研究所なら、施設内にシークエンスをしてくれる部署もあるかもしれませんね。 周囲の人に聞くのが一番かと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.547-11 - 2011/06/22 (水) 07:36:45 - ポスドク２ >PCRで増幅させるのもCreのｃDNAです。 と書かれていたので、CreのmRNAから逆転写酵素で合成したcDNAをテンプレートにしようとしていると思っていましたが、おそらくはテンプレートはプラスミド上のCreをコードしている塩基配列なのですよね。 　おっしゃるとおりです。 >CreをBACに導入したいということですよね。 >論文の通りにホモロジーアームをつけてのPCRで十分だと思います。 　やはりPCRですか・・・。 >>レポーターとのダブルトランスフェクションで、Recombinationがおきるどうか >の確認のため使える金と時間はあるのに、合計1万円程度で済むであろう配列を確認しておかないというのは、私ならば不安です。 　日本にいたときはごく短い配列を自分で機械にかけて読んでいました。アメリカに来てから一回もシークエンスをしていないのですが、こちらは外注で安くできるのでしょうか。長さは３ｋｂを少し超えるのですが。

(無題) 削除/引用 No.547-10 - 2011/06/20 (月) 09:50:34 - ~ てっきりボスに内緒で危ない橋を渡ろうとしているのかと思ってしまいましたが、単なるvector constructionですね。 >PCRで増幅させるのもCreのｃDNAです。 と書かれていたので、CreのmRNAから逆転写酵素で合成したcDNAをテンプレートにしようとしていると思っていましたが、おそらくはテンプレートはプラスミド上のCreをコードしている塩基配列なのですよね。 pGETrecなどを使ったBACの改変などでしょうか。 私はpfuを使っていました。 CreをBACに導入したいということですよね。 論文の通りにホモロジーアームをつけてのPCRで十分だと思います。 >私は変な方向に向かっているのかもしれません。 おそらくはトランスジェニックマウスが出来るまでに半年以上の時間を費やしますよね。 >レポーターとのダブルトランスフェクションで、Recombinationがおきるかどうか の確認のため使える金と時間はあるのに、合計1万円程度で済むであろう配列を確認しておかないというのは、私ならば不安です。

(無題) 削除/引用 No.547-9 - 2011/06/18 (土) 06:54:57 - ら いかにfidelityの高い酵素をつかっても、化学合成でつくるプライマー部分の配列正確性は保証できないですよ。５０ｂｐ＋２０ｂｐもあれば、ＰＡＧＥ精製などしてもそれなりの確率で合成エラーが生じるはずです。

(無題) 削除/引用 No.547-8 - 2011/06/18 (土) 00:31:59 - みどり BAC recombinationで似た様なことをしています。 当方ではPfusionを使っています。

(無題) 削除/引用 No.547-7 - 2011/06/18 (土) 00:25:19 - ポスドク２ 　Creを含むPlasmidはすでに持っています。それをわざわざPCRしたいのは、プライマーによってその両端に５０ｂｐのHomology armを付加したいためです。 　この場合でも、Cre cDNAはPCRをかけずに、その両端にHomology armをつける方向で考えたほうがいいのでしょうか。（BACを使うのはプロモーター側なので、Creに関してはプラスミドでの操作が可能です。） 　あまり詳しくないので、私は変な方向に向かっているのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.547-6 - 2011/06/17 (金) 19:12:48 - AA フナコシでCreのベクターを6万円程度で売っているのを見かけたことがあります。 また、高正確性の酵素はどれもだいたい3万円以上すると思います。 この3万円の差をどう見るかはご自由かと思いますが、 ~様の仰られるように権利的な問題や配列確認をしないことの危険性等々を鑑みるに私ならベクターを買ってもらえるよう、ボスに掛け合うと思います。 plasmidなら買ってしまえばいくらでも増やせますし載せ替えも容易だと思います。 論文でも、この部分はこのベクターから持ってきた、というような表記を見かけますし、こちらが一般的なのではないでしょうか？

ライセンスは大丈夫？ 削除/引用 No.547-5 - 2011/06/17 (金) 17:22:21 - ~ Creの発現ベクターを持っていないため、Cre発現細胞からcDNAのORFを回収して発現ベクターを作りたいということでしょうか。 そのCre発現細胞の分与元はそのような2次使用を認めているのでしょうか？ それがOKならば、その分与元から発現ベクターも貰えると思いますが。 アカデミックならば数万円で発現ベクターが買えますし、 発表できるのか疑問な方法でORFを取ってくるだけの価値があるのか疑問です。 シークエンシングの受託会社も1サンプル千円ちょっとで配列を読んでくれますし、何かぎりぎりのことをやろうとしていませんか？ >会社を超えて公平に性能を比較できる指標 指標の数字違いはError rate等あります。 ただ、同じ酵素でも配列によってerror rateは変わるようですので、ご自分の興味のある配列での比較をしたいのであれば、自分で評価することになるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.547-4 - 2011/06/17 (金) 10:28:59 - ポスドク２ 　ところで 　Fidelityに関して、会社を超えて公平に性能を比較できる指標はありますでしょうか。 ＞LA-taq ＞PrimeSTAR ＞Pyrobest 　たとえば、これらは同じ会社のものですが、どれが一番Fidelityが高いのかわかりにくいように思います。（おそらくPrimeSTARではないかとは思うのですが）

(無題) 削除/引用 No.547-3 - 2011/06/17 (金) 10:02:39 - ポスドク２ 　返信ありがとうございます。 ＞無茶だと思いますが。 ＞発現ベクターを作った後も配列を確認せず、そのままトランスジェニック＞マウス作製にまで使う計画でしょうか？ 　発現させる遺伝子はCreです。PCRで増幅させるのもCreのｃDNAです。microinjection前に培養系で、レポーターとのダブルトランスフェクションで、Recombinationがおきるかどうかは確認しようと思っています。 　ただ、mutationによってRecombinationの率が下がっているようなケースはこれでは確認できないかなと思います。（プロモーター部分はPCRにはかけないので、特異性に影響する心配はありませ） ＞LA-taq ＞PrimeSTAR ＞Pyrobest ＞あたりは3kbのフラグメントを増幅でき、それなりにhigh fidelityです。 ＞増幅されたフラグメントのほとんどはミューテーションを含まないでしょ＞う。 ＞ただ、貴方の研究生活をかけるほどは正確性は高くないと思います。 　参考になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.547-2 - 2011/06/17 (金) 09:55:40 - ~ 無茶だと思いますが。 発現ベクターを作った後も配列を確認せず、そのままトランスジェニックマウス作製にまで使う計画でしょうか？ LA-taq PrimeSTAR Pyrobest あたりは3kbのフラグメントを増幅でき、それなりにhigh fidelityです。 増幅されたフラグメントのほとんどはミューテーションを含まないでしょう。 ただ、貴方の研究生活をかけるほどは正確性は高くないと思います。

PCRの酵素 削除/引用 No.547-1 - 2011/06/17 (金) 08:38:44 - ポスドク２ 　長さが3kbくらいのフラグメントをPCRで増幅し、できればシークエンスをせずに発現ベクター（最終的にはBACトランスジェニックマウス）を作製したいと考えています。 　そこで、３kbの増幅ができ、Fidelityの高い酵素を何か紹介していただけないでしょうか。 　どうぞよろしくお願いいたします。

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