全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.541-8 - 2011/06/19 (日) 11:55:02 - mbp 実験系をほとんど理解出来ていませんが、 PHドメインってgoogleで見た感じ脂質結合ドメインなんですか？ 扱いが難しそうですね。 GST融合タンパクとMBP融合タンパクなので、確認的としてMBP融合タンパクの方を落とすような実験もするのはいかがでしょうか？ PHドメインがGST融合タンパクなのか？MBP融合タンパクなのか？が分かりませんが、 MBP融合タンパクの場合、 GST-XXXとMBP-PHは結合するが GSTとMBP-PHは結合しないと言うことで XXXとPHドメインは結合すると言う判断になるんでしょうか？ GST融合タンパクの場合、 GST-PHが樹脂についた段階で変性してMBP融合タンパクを何でもべたべたくっつけている、なんて事は。（PHドメインの扱いが難しそうなので）（でも、なさそうですね精製しているんだし）

(無題) 削除/引用 No.541-7 - 2011/06/17 (金) 05:55:24 - おお 界面活性剤についてですが、例えばセルライセートなどでIPした実験があるなら、そのバッファーの組成を使ってみるのもてかもしれません。TRITONXー100やNPー40なら1%位は使っていると思います。

(無題) 削除/引用 No.541-6 - 2011/06/16 (木) 19:14:44 - NP-40 ライセートによる結合実験ではNETN bufferなどがよく使われますね。組成にバリエーションがあるようですがたとえば： NETN buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.9, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA,　0.2% NP-40) Tritonはあまり聞かないので、何かあるかもしれません。TritonはSDSゲルと多少相性が悪いとか実践的なことか？ 条件は、変え始めるときりがありませんから、代表的な論文のを２，３採用してみるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.541-5 - 2011/06/16 (木) 12:50:41 - GST > モル比が分かりませんが1オーダー位は減らせますよね、結合がしっかりしていて、抗体で検出しているなら。抗体で検出しているならCBBなどの染色でみて見る手もあるかもしれませんよ、ウエスタンより検出に直線性があり、弱い結合は検出ができないかもしれません。 なるほど、ＣＢＢという手は思いつきませんでした。 確かにＷＢは差が見にくいので、いいかもしれません。 早速試してみます。

(無題) 削除/引用 No.541-4 - 2011/06/16 (木) 08:03:45 - おお >[Re:3] GSTさんは書きました : > おおさんお返事ありがとうございました。 > > > 結合しないと言う事が本当に分かっているのでしょうか。 > > 厳密にはわかってないのですが、そのドメイン（ＰＨドメインなのですが）はどのタンパク質とも結合してしまうので、おそらくネガではないかと思っています。 > > > > 結合はタンパクを介しているでしょうか。支持体に直接ついているとか。 > > ＧＳＴのみだと、バンドが検出されることはありません。 > > > そうですか。ほかのタンパク質を入れるのはあまりよくないのですね。 > よくないとまで言い切りませんけどね。。。安定剤としてBSA入れているリコンビナントもあるくらいですから、邪魔しなければそれはそれでいいかとはおもいますが、実験でそういうのを入れたものをあまり見たことがないようなきもします。入れるとするならばタンパク量にして10倍以上は欲しいと思いますが。 何かの理由でくっつかないと思えるものがくっつく時はその理由を元にしきいちを設定するすなわちそれについてはネガに出るように条件を設定することはいいと思いますが、それがくっつくはずだ、くっつかないはずだと思ってしまうところに怖さがあります。 >ＧＳＴ融合タンパク質 0.3μg にＭＢＰ融合タンパク質　１μg　入れて、グルタチオンセファロースで落としてきています。 モル比が分かりませんが1オーダー位は減らせますよね、結合がしっかりしていて、抗体で検出しているなら。抗体で検出しているならCBBなどの染色でみて見る手もあるかもしれませんよ、ウエスタンより検出に直線性があり、弱い結合は検出ができないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.541-3 - 2011/06/16 (木) 07:19:46 - GST おおさんお返事ありがとうございました。 > 結合しないと言う事が本当に分かっているのでしょうか。 厳密にはわかってないのですが、そのドメイン（ＰＨドメインなのですが）はどのタンパク質とも結合してしまうので、おそらくネガではないかと思っています。 > 結合はタンパクを介しているでしょうか。支持体に直接ついているとか。 ＧＳＴのみだと、バンドが検出されることはありません。 > デタージェント濃度や変更に加え塩濃度を上げるとかも検討の余地があるかもしれません。支持体への結合であればBSAなどの蛋白もやってみてもいいかもしれません。個人的にはたんぱくの相互作用でほかのタンパクを入れたくないというのが心情です。 そうですか。ほかのタンパク質を入れるのはあまりよくないのですね。 > また両者のタンパク濃度が生理的に比べて高すぎる可能性も考えてみてはどうでしょうか。 ＧＳＴ融合タンパク質 0.3μg にＭＢＰ融合タンパク質　１μg　入れて、グルタチオンセファロースで落としてきています。 > またはKd値をその条件で算出して結合力の強さと生理的な意義に関してそのデーターでdiscussionに持ち込んでもいいかもしれません。 なるほど・・・。大変勉強になります。

(無題) 削除/引用 No.541-2 - 2011/06/16 (木) 06:02:49 - おお >ドメインによっては結合するはずのないタンパク質が結合してしまいます。 結合しないと言う事が本当に分かっているのでしょうか。 結合はタンパクを介しているでしょうか。支持体に直接ついているとか。 ネガコンは有りますか? デタージェント濃度や変更に加え塩濃度を上げるとかも検討の余地があるかもしれません。支持体への結合であればBSAなどの蛋白もやってみてもいいかもしれません。個人的にはたんぱくの相互作用でほかのタンパクを入れたくないというのが心情です。 また両者のタンパク濃度が生理的に比べて高すぎる可能性も考えてみてはどうでしょうか。 またはKd値をその条件で算出して結合力の強さと生理的な意義に関してそのデーターでdiscussionに持ち込んでもいいかもしれません。

精製したタンパク質を用いた結合実験 削除/引用 No.541-1 - 2011/06/16 (木) 04:57:33 - GST 精製したタンパク質を用いた結合実験を行っております。 ＧＳＴ融合タンパク質をベイトにしています。 お聞きしたいのは、結合させるときの条件です。 室温で１時間、0.3% Triton-X、ＢＳＡやＦＢＳなしで行っているのですが、ドメインによっては結合するはずのないタンパク質が結合してしまいます。 条件をきつくしたいのですが、４℃にすべきか、Triton の濃度をあげるべきか、ＢＳＡやＦＢＳ（どれくらいの濃度？）を入れるべきか迷っています。 もちろん全て検討したほうがいいのですが、経験者の方のご意見をうかがえると幸いです。 よろしくお願いいたします。

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---