全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.534-10 - 2011/06/21 (火) 17:15:12 - qq 私もM２さんの意見と同じです。 ＞0.5M Gdn, Tween40 0.05%, pH7.6 Tris-HCl 50mM のGdnはグアニジン塩酸のことだと思うのですが、0.5Mはいやに中途半端な濃度です。 タンパク質の変性溶解に使う濃度なら6Mだと思うのですが、何か実験の都合があるのかもしれません。いずれにしても、「グアニジンを含有する沈殿に含まれるタンパク質」をSDS-PAGEするのはなかなか難しいので、注意してください。沈殿をTCAでもう一度リンスし、グアニジンを除去する方がよろしいです。

(無題) 削除/引用 No.534-9 - 2011/06/19 (日) 04:15:29 - M2 自信はないですが。 0.5mg／mlの10倍希釈で、0.05mg／ml ＞遠心前と遠心後の沈殿のタンパク質量を比べても、沈殿の量が明らかに少ないので、 と言う事から、半分くらいは溶液中に存在しているとすると 0.025mg/ml 10マイクロリットル流せば、0.25マイクログラムほど流した事になるので電気泳動後CBB染色で検出可能な範囲内かなと思います。 そこで、 1.そのまま電気泳動に供する（Gdnが何の略称か知らなくて申し訳ないですが、十分希釈されているので、SDS電気泳動可能？） 2.BCA法か何かでTCA沈殿させる前のサンプルのタンパク濃度の確認（ある程度、希釈後の上清に来ている事を確認するため） 3.TCA沈殿の代替法として、透析を行う は如何でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.534-7 - 2011/06/17 (金) 13:44:08 - M1 情報が少なくてすいませんでした。 希釈前の溶液の組成は 0.5M Gdn, Tween40 0.05%, pH7.6 Tris-HCl 50mM タンパク質濃度が0.5mg/ml〜1mg/mlです これを50mM Tris-HCl, 150mM NaClの溶液でそれぞれ２倍、５倍、１０倍に希釈します。これをO/N 置いた後、21000×g, 30minで上清と沈殿に分け、上清と遠心前の溶液は、20%TCAを等量混ぜ、氷上で1h以上置いた後、14000×g, 10minで沈殿させ、SDS-PAGEでバンドを確認しています。 バンドは希釈前のバンドの濃さを１とすると、希釈後の遠心前が0.5くらい、希釈後の沈殿は僅かに見える位です。 希釈後の溶液の全体量は２倍で240μl, ５倍で600μl, １０倍で1200μlです。 キャリアーなどは特に用いていませんが、使うとしたらグリコーゲンがいいだろうと先生はおっしゃられていました。

(無題) 削除/引用 No.534-6 - 2011/06/16 (木) 07:56:48 - Boston-Pullman 勘違いしてました。すみません。

(無題) 削除/引用 No.534-5 - 2011/06/16 (木) 03:30:29 - Boston-Pullman pHの問題じゃないでしょうか。変性させるときの溶液の組成はどのようなものでしょうか？トリスといった緩衝剤が入っているような気がします。

(無題) 削除/引用 No.534-4 - 2011/06/15 (水) 22:25:39 - M >遠心前と遠心後の沈殿のタンパク質量を比べても 遠心前と遠心後とは、どの段階ですか？希釈後TCA入れる前に遠心したときの沈殿と、希釈後そのままTCAを入れて遠心したときの沈殿の比較でしょうか？この場合、タンパク質量の比較は変性剤入りの緩衝液で溶かし直してタンパク定量して比較したのでしょうか？ タンパク量が明らかに違うのであれば、希釈後、上清に溶けているタンパク量も見積もることが出来そうですが、電気泳動で確認するのに十分ありそうですか？ 質問ばかりですいません。 とりあえず、半年様の ＞キャリアー、BSAなどを普通は使います。 を試してみるのが良いかもしえませんね。 あと無理矢理頑張るなら遠心の条件を強くしてもいいかもしれません。頑張ってください。

(無題) 削除/引用 No.534-3 - 2011/06/15 (水) 22:15:25 - qq ＞変性剤で可溶化したタンパク質 のタンパク濃度はどの程度なの？ ＞変性剤で可溶化したタンパク質を希釈して、遠心をかけて上清をとり、 の上清ではどの程度希釈したの？ ＞遠心前と遠心後の沈殿のタンパク質量を比べても、沈殿の量が明らかに少ないので、 とのことですが、チューブの壁面全体に薄くべったり付いている可能性はないでしょうか？あと、目に見える沈殿は必ずしもたんぱく質であるとは限りません。DNAや脂質などいろいろです。

(無題) 削除/引用 No.534-2 - 2011/06/15 (水) 22:02:10 - 半年 キャリアー、BSAなどを普通は使います。

TCA沈殿でタンパク質が落ちてこない 削除/引用 No.534-1 - 2011/06/15 (水) 14:16:37 - M1 現在タンパク質のリフォールディングを行っています。変性剤で可溶化したタンパク質を希釈して、遠心をかけて上清をとり、それをSDSPAGEで確認するためにTCAで落とそうとしているのですが落ちてきません。 遠心前で沈殿が溶液中にある状態の物をTCAで落とすと沈殿するのですが、上清だけにすると、上清にはタンパク質のバンドが一切見られません。 遠心前と遠心後の沈殿のタンパク質量を比べても、沈殿の量が明らかに少ないので、上清に来ているはずなのですが……分解物らしきバンドもみられていないので分解されているという事もあまり考えられません。 希釈後のタンパク質溶液は相当濃度が薄くなっているので、溶けているタンパク質だけでは落ちにくいのではないかと担当の先生はおっしゃられています。 うまく沈殿させる方法はないでしょうか？

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---