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Plasmidに組み込まれたHetero2本鎖配列 トピック削除
No.532-TOPIC - 2011/06/15 (水) 07:24:54 - 310
いつもお世話になっています。
PCRの結果、配列の中に可変配列又はSNPを持つヘテロ2本鎖が出来た場合、このヘテロ2本鎖をベクターにライゲーションした後、大腸菌にトランスフォーメーションして増やすと、それぞれの配列を持つ大腸菌が1つのコロニーに混在することがあるのでしょうか？

実は単一コロニーを拾ったつもりが、シークエンスでヘテロに出てしまうことが、以前短い可変配列をクローニングした際にありました。私が2つのコロニーを拾ってしまっていたと、いままで思っていましたが、上記のような減少が起きるのであれば、PCRサイクル控えめ＆反応容量増加をした方がいいと思っています。

また25-30サイクルでプラトーになる可変部位のPCRをリアルタイムPCR後のHigh Resolution Melting Tempertureで解析した際、35サイクルを超えるとヘテロを示すピークが増加していました。denature-annealing-denatureのステップを踏むので、PCR中に出来たヘテロ2本鎖は影響しないと思っていましたが、完全に解離せずに残り、影響を与えているのかもしれませんし、よく分からなくなってきました。識者のご意見をお待ちしております。
　
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No.532-6 - 2011/06/22 (水) 04:46:07 - 310
FL様、中年様、半年様

お教えいただきありがとうございました。混在しうるということなので、今後は、インサートDNAのPCRサイクルが過剰にならぬよう注意しようと思います。コロニーが少なく混ざったクローンも必要になる際は希釈して撒きなおすか、画線培養しようと思います。

(無題) 削除/引用
No.532-5 - 2011/06/15 (水) 21:22:58 - 半年
昔、ここで話題になったのですが、プラスミドの不和合性による単一の種類のプラスミド選択は、常識に反して必ずしも起こらないということでした。つまり、ヘテロなプラスミドが混在しうる。

「PCRの結果、配列の中に可変配列又はSNPを持つヘテロ2本鎖が出来た場合、」という状況ですが、複製エラーの確率から現実的には同一箇所でおこることは無視しえると思います。ただし、ポリAなど配列が特殊で複製エラーがおきる場合を除きます。

たとえそれが現実に起こっても、配列チャート上でヘテロは認識可能であり、疑いのある場合は、複数のコロニーからやり直せばいいでしょう。

(無題) 削除/引用
No.532-4 - 2011/06/15 (水) 20:55:26 - 中年
詳しくは以前のこのトピックを参照してください。

http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=3040

(無題) 削除/引用
No.532-3 - 2011/06/15 (水) 20:49:24 - 中年
PCRに起因すると考えられるエラーを持ったプラスミドと持たないプラスミドがシングルコロニーから得られた経験がありますので、混在することはあると思います。ただし、それはヘテロ二本鎖の修復し損ないではなくて、複数のプラスミドが単一のコンピテントセルを形質転換したからではないでしょうか。

いずれにせよ、最初に得られた形質転換体から再びシングルコロニーアイソレーションをすることで、プラスミドの不和合性を利用して単一の配列を持つプラスミドを選択することができます。

(無題) 削除/引用
No.532-2 - 2011/06/15 (水) 19:49:50 - FL
そのようなプラスミドは大腸菌内でＤＮＡ修復機構が修復するのではないでしょうか。
プラスミドのニックなどが修復されるように。

Plasmidに組み込まれたHetero2本鎖配列 削除/引用
No.532-1 - 2011/06/15 (水) 07:24:54 - 310
いつもお世話になっています。
PCRの結果、配列の中に可変配列又はSNPを持つヘテロ2本鎖が出来た場合、このヘテロ2本鎖をベクターにライゲーションした後、大腸菌にトランスフォーメーションして増やすと、それぞれの配列を持つ大腸菌が1つのコロニーに混在することがあるのでしょうか？

実は単一コロニーを拾ったつもりが、シークエンスでヘテロに出てしまうことが、以前短い可変配列をクローニングした際にありました。私が2つのコロニーを拾ってしまっていたと、いままで思っていましたが、上記のような減少が起きるのであれば、PCRサイクル控えめ＆反応容量増加をした方がいいと思っています。

また25-30サイクルでプラトーになる可変部位のPCRをリアルタイムPCR後のHigh Resolution Melting Tempertureで解析した際、35サイクルを超えるとヘテロを示すピークが増加していました。denature-annealing-denatureのステップを踏むので、PCR中に出来たヘテロ2本鎖は影響しないと思っていましたが、完全に解離せずに残り、影響を与えているのかもしれませんし、よく分からなくなってきました。識者のご意見をお待ちしております。
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