初心者質問で恐縮です。
とある特定のタンパク質発現に対する、small moleculeの影響をタイムコース（Day1, 2, and 5）で
みたいと思ってます。検出はウェスタンブロッティングです。
きっちりとしたきれいな、定量的なデータを取るにあたり、下記のポイントが気になっています。
1. 安定した回収を望める播種細胞数
浮遊細胞を主に用いているため、ウェルから回収して遠心→洗いのステップが入ってきます。
トータル細胞数でどれくらいの数を目安に播種されているでしょうか？特にDay1ではcell pelletが
見えづらく、本当に回収できているか不安です。6-well plateで1 x 10^6 cellsでseedした場合でも
Day1だとアスピレートするときはほとんどみえてなかったです。
解決法として考えているのは、たんに大きめのディッシュを使ってscale upするか、通常の培養よりもscale downしているから、遠心やチューブの違いがcell pellet回収率悪の原因かも、と考えていますが、経験豊富な方はどうされているでしょうか？
接着細胞ならばsmall scaleでもそれほど心配はないのですが
2. 定量のためのSDS-PAGEでのアプライ量の決定法
検出はウェスタンブロッティングなので、当然ながら、アプライする各サンプルでの
トータルタンパク量は同じにしておかないと、化合物のとあるタンパク質の発現量に対する影響を
定量できません。そのコントロールとしてはb-actinを用いる予定ですので、つまり、言い換えると、
b-actinのバンドのintensityがサンプル間で同じでなければならないわけです。
タイムコースを取りたいので、Day1, 2 ,and 5で同じようにサンプリングしますが、
各タイムポイントでの細胞数は大きく異なります。したがって、SDS-PAGEでアプライする量を
適宜調整しないといけないわけです。
考えている方法としては、i) 各サンプルのタンパク定量を行ってアプライ量を決める、ii) 各タイムポイントでの細胞数をあらかじめ測定しておき、そこからアプライ量を見積もる、iii) とりあえず、感覚的に（＝勘）でアプライ量を決めてウェスタンブロッティングを行い、結果をみてアプライ量を調整し、再度SDS-PAGE、ですが、経験豊富な方々はどうされていますでしょうか？
長々と、素人質問ですが、お答えいただければ幸甚です。
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