全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.513-5 - 2011/06/14 (火) 06:30:53 - 310 >ちなみに鋳型のオーバーラップの距離と各プライマーのサイズは関係あるの >でしょうか。 オーバーラップの距離は、オーバーラップを利用した2本鎖DNA合成の成否には、関わると思いますが、プライマーとはあまり関係ないと思います。 何らかの方法で（プラスミドへのクローニングやオーバーラップ配列周囲のプライマーを使ったPCR）でオーバーラップのアニーリングと2本鎖合成がうまく出来ているか、確認できているでしょうか？何らかの理由でプライマーのアニーリングサイトがつぶれてしまっているかどうかは、クローニングした後のシーケンスで確認できると思います。 大腸菌のDNA合成はPCRに使われている酵素より忠実製が高いので、最初にPCRをした際、変異の頻度の低いポリメラーゼを使用しているのであれば、クローニングしたプラスミドに入ったターゲットを鋳型にして少ないサイクルのPCRをかけるのが、よいと思います。この際重要な部位のDNA配列は変異が無いことを確認することをお勧めします。 それでもうまくいかない際は、私ならGC-richな配列でも増えるPCR酵素を使います。私はプライマーの配列や長さは、ゲノムから増えているような場合には大丈夫だと思い、いじくるのは鋳型の方でプライマーを変えるのはそのあとにします。

(無題) 削除/引用 No.513-4 - 2011/06/11 (土) 16:27:28 - おお >[Re:1] Sukiya-Sukiyaさんは書きました : > 現在、transgenic用にコンストラクトを作っています。目的サイズは6kbです。3kと3kまでは作れて、これのオーバーラップを試みていますが、うまく6kがかかりません。ゲノムから3kのフラグメントを取ってくるときに、長鎖を取ってくることもあってプライマー長を30merほどにしてあるのですが、このサイズが問題なのでしょうか。いったんゲノムからフラグメントを取って来たら、30merなどよりもむしろ20-23merくらいでPCRをした方がよろしいでしょうか。ご教授ください。 > ちなみに鋳型のオーバーラップの距離と各プライマーのサイズは関係あるのでしょうか。 30merという長さにはあまり問題を感じません。しかもゲノムからはそのプライマーで6kbpを増やせるわけですから(そういうふうに取りましたがそうでなければご指摘ください)。鋳型のオーバーラップの距離と各プライマーのサイズも直接は関係ないと思います。最初の段階でうまくオーバーラップさせた所をアニーリングできるかだと思います(やり方によっては初段階出なくてもオーバーラップしてくれればうまく行くかもしれません)。

(無題) 削除/引用 No.513-3 - 2011/06/11 (土) 16:06:45 - Sukiya-Sukiya ありがとうございます。 >まず3ｋｂのフラグメント同士をアニーリングさせて、6ｋｂのフラグメントを作った後でPCRをかけているのでしょうか？ 鋳型は95℃10分でdenatureして、60℃20分、37℃20分、室温20分、というように環境を変えて徐々に冷やしました。 ゲノムをテンプレートにすると、同じfoward/reverseのプライマーの組合せでPCRがかかるので、相性は大丈夫と思っていましたが、ゲノムからフラグメントになると変わるということも含めて考えてみます。 ちなみに鋳型のオーバーラップの距離と各プライマーのサイズは関係あるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.513-2 - 2011/06/11 (土) 12:37:09 - 310 >これのオーバーラップ オーバーラップさせるときは、まず3ｋｂのフラグメント同士をアニーリングさせて、6ｋｂのフラグメントを作った後でPCRをかけているのでしょうか？以前タカラの実習でやっただけですが、この方法は、かなりじわじわアニールさせないとうまくできなかったと記憶しています。しかし一旦6ｋｂの2本鎖が形成された後のPCRは普通だったと思います。 5’付加配列がついた30bpを超えるプライマーで150bp程度のPCRフラグメントを鋳型にPCRをかけたこともありますが、増えました。ただし、ここまで極端だと、鋳型のアニーリングがプライマーのアニーリングと競合しますので、プラトーになるのが早いと思います。 6kbも長さがあると、コピー数でプライマーに追いつく前に相当増えると思います。むしろ、foward/reverseのプライマーの相性、PCR反応条件、GC-richな内部配列などが問題になるかもしれません。DNAの構造は周辺配列があったゲノムからフラグメントになると変わると思います。 私の経験で、同じシーケンスプライマーを使っても、PCR産物では読みにくく（要変性剤）プラスミドに入れると読みやすいことがありました。 あまり的確で無い話でしたら申し訳ありませんでした。

プライマーのサイズ 削除/引用 No.513-1 - 2011/06/11 (土) 10:27:30 - Sukiya-Sukiya 現在、transgenic用にコンストラクトを作っています。目的サイズは6kbです。3kと3kまでは作れて、これのオーバーラップを試みていますが、うまく6kがかかりません。ゲノムから3kのフラグメントを取ってくるときに、長鎖を取ってくることもあってプライマー長を30merほどにしてあるのですが、このサイズが問題なのでしょうか。いったんゲノムからフラグメントを取って来たら、30merなどよりもむしろ20-23merくらいでPCRをした方がよろしいでしょうか。ご教授ください。

全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---