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(無題) 削除/引用 No.511-3 - 2011/06/11 (土) 16:35:39 - おお >[Re:1] fireさんは書きました : > 最初の頃はcDNAをPCRしてもプライマーダイマーは検出されなかったのに、 > 何回もPCRを行っているうち 何回もPCRを行っているというのは具体的にどう言うことをいおうとしているのでしょうか。cDNAから同じサンプルをPCRするという実験を繰り返したと言う事ですか。 cDNAをPCRした産物をさらにPCRして増やしたりしたと言う事ですか。。。 よく分からないですが酵素がへたっている。プライマーがへたっている(ヌクレアーゼのコンタミとか、凍結融解の極端な繰り返しとか)といった可能性はありませんか?

(無題) 削除/引用 No.511-2 - 2011/06/11 (土) 03:00:16 - 310 プライマー冷蔵保存-保存中にダイマー形成。避けるべき。 プライマー冷凍保存-凍結融解でプライマーの一部切れる。配列の特異性減少。しかし複数回の凍結融解で問題ないprimerもあります。 一般的には100uMのプライマー溶液を小分けにしておき、希釈して使用し数回の凍結融解で廃棄と言うことをします。プライマーをペアにして保存しないことも大事です。 うちのラボではプライマーを小分けして保存する場所がないので、私はDNase/RNase Freeのグリセロールと100-200uMプライマーの1:1混合液を作り-20Cで保存しています。これをdH2Oで希釈し1-2回の凍結保存で廃棄をしています。この方法が正解か分かりませんが、いまのところ問題はありません。 PCRに関する試薬の中でprimerは、もっとも暖めてはいけないものです。十分な冷蔵方法（氷）が無い場合、混合の最後に入れるようにしてすぐ保管場所に戻す。Hotstartの酵素を使う。ブロックをあらかじめ変性温度にしておく。などでprimer dimerの発生を最小限にできます。 しかし、適当に扱っても平気なプライマーもあります。ルーチンで使っていて経験則で大丈夫なprimerは、同じラボのほかの人と同じように使えば平気でしょう。

プライマーダイマー 削除/引用 No.511-1 - 2011/06/10 (金) 18:05:54 - fire 最初の頃はcDNAをPCRしてもプライマーダイマーは検出されなかったのに、 何回もPCRを行っているうちにプライマーダイマーが検出され、 さらに目的の産物も増えが悪くなってきています。 一体、どういうことが考えられるでしょうか？

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