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どうもありがとうございます 削除/引用 No.510-8 - 2011/06/28 (火) 18:08:09 - だい abさんへ ご親切に教えてくださり、どうもありがとうございます。 陽性コントロールの練習になりそうです。 やってみます。

(無題) 削除/引用 No.510-7 - 2011/06/28 (火) 05:58:09 - ab > �@固定する前にDNase処理をするという認識でよいですか？ > �A普通にDNAを処理するときのMQの代わりにPBSを用いてやるだけでよいですか？bufferなどはどうしたらよいですか？ > �Bそれとも固定、Triton処理後にDNase処理をするのでしょうか？ DNase処理は固定して膜透過処理をしてから行います（酵素が細胞内に入らないから）。 PromegaのTUNELキットのプロトコールに詳細が書いていました。 ご参考までに。 http://www.promega.co.jp/jp/jp_tech/jp_manuals/DeadEnd_Flurometric_j.pdf

細胞のDNase処理について 削除/引用 No.510-6 - 2011/06/27 (月) 14:49:37 - だい abさんへ ご親切な回答をどうもありがとうございます。DNase処理、やってみようと思います。ちなみに、細胞のDNase処理はどのようにすればよいのでしょうか？以下、お教えいただけますか。 �@固定する前にDNase処理をするという認識でよいですか？ �A普通にDNAを処理するときのMQの代わりにPBSを用いてやるだけでよいですか？bufferなどはどうしたらよいですか？ �Bそれとも固定、Triton処理後にDNase処理をするのでしょうか？ よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.510-5 - 2011/06/16 (木) 00:30:02 - ab TdTの反応が上手くできているか確認はしていますか？ 固定した後にDNase Iで処理した細胞をコントロールに用いると、TdT以降の過程に問題がないか確認できます。DNAがずたずたになるので、ほぼ全ての細胞が陽性になります。 また、TdTを入れない場合はどうなるか確認していますか？ TdTの有無に関わらずシグナルが同じであれば、非特異的なシグナルか自家蛍光です。 FITCは褪色が早いですが、遮光については大丈夫でしょうか。 組織でなく培養細胞であれば、Proteinase K処理は必ずしも必要ではないです。

どうもありがとうございます 削除/引用 No.510-4 - 2011/06/15 (水) 16:37:27 - だい ご意見どうもありがとうございます。返信が滞ってすみません。 DAPIでDNAの断片化はある程度起こっているので、アポトーシスは確かに起こっていると思います。DNA ladderも確認しています。PIやカスパーゼの経路も確認してみます。 細胞によってDAPIでは染まりやすくてもTUNELでは染まりにくいなど、そういうことはあるのでしょうか？Protenase Kなどで処理するとうまくいくようなことはありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.510-3 - 2011/06/11 (土) 12:41:52 - 310 アポトーシスの経路が分かっているのであれば、適応する活性型カスパーゼで染めてみるのもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.510-2 - 2011/06/10 (金) 18:01:02 - カイ キットがうまくいっているかの前に、アポトーシスは起こっているでしょうか？ DAPIで核を染めているなら、核の凝縮とか、ストレス処理の細胞と無処理の細胞で違う感じに見えると思うのですが。 私はRocheのを使ったので、TAKARAのはわかりませんが、非常に簡単な操作でうまくいった印象がありました。 PI(propidiumiodide)とかcalceinAMなどでも確かめてみてはいかがでしょうか。 PIは安価で簡単です。

TUNEL assayについて 削除/引用 No.510-1 - 2011/06/10 (金) 16:35:52 - だい TUNEL assayで細胞のapoptosisを検証しようとしています。小胞体ストレスを引き起こすサプシガルジン(Tg)を2μM 24hr処理してapoptosisをおこさせ、TAKARAのIn situ apoptosis detection KitでTUNEL染色してみましたが、あまりよく染まりません。というか、apoptosisを起こしていないはずの無処理の細胞までFITCで弱く緑に光っており、Tg処理した細胞と同じくらいの光り方です。同時に行ったDAPI染色では核はきれいに染まっているので固定とその後の膜に穴をあける操作はうまくいっていると思われるのですが、apoptosisを起こしていない細胞でも染まってしまうようなことはあるのでしょうか？また、キット間での差異などはありますでしょうか？御経験のある方のアドバイスを頂けると幸いです。よろしくお願いいたします。

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