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(無題) 削除/引用 No.51-20 - 2011/02/23 (水) 15:21:09 - ImageJ 大海先生のひとくちメモは参考になりました。定量のところ以外の、ブロッティングバッファーにSDSを入れるなど(皆さんには当たり前なのかもしれませんが)知らないことが色々書いてあり非常にためになりました。 関連トピや皆様のご意見を聞いて、皆さんの知識の深さにただただ驚くばかりです(大げさですが正直な気持ちです)。 モモさんも説明ありがとうございました。完全には理解しきれていませんが、理論的に考えスキャナの設定を変えるなど考えたこともありませんでした。また、ImageJでデータをODに変えるという部分は、そんなことができるんだというレベルですが、もっと勉強します。

OD 削除/引用 No.51-19 - 2011/02/23 (水) 05:38:08 - モモ みなさんの示されたリンク先をすべて正確に理解すればあるいは正解にたどり着けるかもしれませんが、恐らく読み飛ばすと思うので私見を書いておきます。 定量性が一番良いのは蛍光標識を蛍光スキャナで読み取る場合です。 蛋白量ー抗体量ー蛍光量ーCCD のすべてが一応比例関係にあると思います。 さて、X線フィルムを使うときに正しい方法はODを測定する方法です。 デンシトメータはODを測定する方法です。 ですから、デンシトメータを使った方法は間違いとは言えませんが、 フィルムの直線性の問題があって、最初の方法よりは直線性が劣ります。 それでも 蛋白量ー抗体量ー発光量ーフィルムのOD の関係が一応直線性が悪いながらも比例するわけです。 ここまで書けばお気づきとは思いますが、スキャナを使ったときの方法として正しいのは、 まず、スキャンするときにソフトの自動補正を完全にOffにします。 これはガンマ設定も含めてです。これで、スキャン時の光量とCCDデータを 直線的な関係にします。 つぎに得られたデータをImageJ上でODに変換します。 その後バンドを定量します。 この、ODに変換することで正しい方法となるわけです。 CCDで読み込んだデータは光量に比例するデータであって、ODではないところを理解してください。

(無題) 削除/引用 No.51-18 - 2011/02/22 (火) 14:06:10 - ご参考までに 大海忍先生が細胞工学に昔連載していた「ラボラトリーひとくちメモ」から http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/ohmiken/Labメモ/memo16.html ＃URLに全角文字が入っているので途中までしかリンクが張られませんが、最後のhtmlまでがすべてのURLなのでコピペして開いてください。

(無題) 削除/引用 No.51-15 - 2011/02/22 (火) 13:29:28 - ImageJ 皆さん本当にありがとうございます。 TSさんやaaaさんの言われるように検量線を作成して目安にするというのは納得がいきます。 本当に勉強になりました。 稚拙な質問に真摯に色々ご指導いただきうれしかったです。

検量線 削除/引用 No.51-14 - 2011/02/22 (火) 12:12:42 - aaa いくつかのコメントに出ているようですが、検量線を作成することに賛成させて下さい。 いずれかのサンプルの量を振って流し、直線でもカーブでも形は問いませんが、検量線を作成すれば、シグナルが単調増加する範囲で見ている限り、どのような数値化方法でもある程度の目安にはなるんじゃないでしょうか。 単なる個人的な意見ですが・・・、参考までに。

(無題) 削除/引用 No.51-13 - 2011/02/22 (火) 10:30:09 - 小言幸兵衛 お呼びでないかもしれませんが、以前にあった関連トピを挙げておきます。 www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2283 www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=150 www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=3781

(無題) 削除/引用 No.51-12 - 2011/02/22 (火) 04:23:55 - ImageJ 皆様丁寧に教えていただきありがとうございます。 ImageJでの評価の仕方は判った気がします。 あくまでも半定量であり、数値にこだわりすぎてもあまり意味がないのは判ってはいるつもりなのですが、多くの論文がそうしてデータを出し周りもそうしているのでそうしたくなってしまいます。 向学のために教えていただきたいのですが、モモさんなどはウェスタンをどう評価されているのでしょうか。他の評価の仕方があるのでしょうか。不勉強ですみません。

OD 削除/引用 No.51-11 - 2011/02/22 (火) 03:20:12 - モモ フィルムをスキャンして得られたデータをそのまま定量してもねぇ・・・

(無題) 削除/引用 No.51-10 - 2011/02/21 (月) 18:37:53 - TS 質問者さんが誤解している部分がある気がしますので、私なりに補足します。 バンドの濃淡とタンパク質量が完全に直線的な関係にないことも多いですが（たぶん直線的関係にあるレンジもあると思うんですけど）、数値化に意味がないわけではないと思います。 動物試験を含め、統計的処理が必要な場合、数値化、統計処理を行う意味はあると思います。 ただ、Arbitrary unitなどで表現した場合の１と２には、量的に２倍の関係にはなっていない可能性が十分にある、ということです。 絶対定量、あるいは相対定量が必要であれば、既知濃度の抗原を流すとか、どのサンプルでも良いので、異なる量を流して、タンパク量（あるいは相対的な量）とデンシトメトリーをグラフにプロットすれば、たとえ２次曲線のようなプロットになっても、その近似式から量的な比較できます。

(無題) 削除/引用 No.51-9 - 2011/02/21 (月) 15:52:41 - 小言幸兵衛 はい。それも先の説明のとおりです。 ただ、そのような取扱いをしてそれで良しとしている論文が世の中に沢山あることや、場合によってはそうやって定量した数値を要求してくる査読者がいることは付け加えておきます。

(無題) 削除/引用 No.51-8 - 2011/02/21 (月) 15:37:15 - ImageJ backgroundの値で割るのではなく、目的とする蛋白のシグナルの値をcontrolのhousekeeping gene(alfpha-tubulinやbeta-actin)のシグナルの値で割っているのですが、それも意味がないということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.51-7 - 2011/02/21 (月) 15:24:58 - 小言幸兵衛 余計なお世話ではありますが、ケミルミをＸ線フィルムに感光したシグナルの強度は抗原量に対してプロットしても原点を通る直線にはなりません。そのような非線形のデータの場合、シグナルの値をバックグラウンドの値で割って得られた数値に定量的な意味はほとんどありませんよ。

ありがとうございます 削除/引用 No.51-6 - 2011/02/21 (月) 14:47:51 - ImageJ 早速のお返事ありがとうございます。 同僚に教えてもらったやり方とお二人から教えていただいたやり方とやはり少し違う気がしました。 同僚に教えてもらったブロットの囲み方は、フリーハンドでブロットを囲むやり方だったのですが、やっていてresultに違和感を感じていました(Analyze-Gelsなどはやっていません)。 すぐにはできないのですが、明日には教えていただいたやり方をやってみます。万が一それでもわからなければまた質問をさせていただくかもしれませんが、よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.51-5 - 2011/02/21 (月) 13:25:07 - blot この機能はImageJの中に専用のプラグインが用意されてますよ。まずスキャンした画像の一つのレーン全体を縦長（横長はだめ）に四角形で選択して、 Analyze>Gelsの中のSelect first laneというのを選んで、そこを認識させ、その枠をそのまま横に動かし（カーソルが便利）、次のレーンにおいて、 Analyze>Gels>SelectSecondLaneで認識させ、というのを繰り返して全部のレーンを認識させて、最後にplot lanesを選んで、全体の定量図を表示させ、次に、その定量グラフのバンドの底と思われる部分に線を引いてそのバンドを閉じて、これを全部のレーンでやります。で、囲んだ部分は、wands toolというのでしたっけ、魔法の杖の意味ですが、これでそこを触るとグラフが出て、定量された数値が出ます。下手なソフトよりよほどちゃんと定量できますよ。

(無題) 削除/引用 No.51-2 - 2011/02/21 (月) 10:12:04 - TS やりたいことはわかるのですが、以下の２つのステップ間でやっていることが一番重要だと思います。そこが書いてないので。。。 ・ブロットを一つ一つ囲む ・上記の方法で得られたブロットのMeanを同様の方法で得られたControlのMeanで割った数値を用いる Analyze-Gels-。。。とかをいろいろやってるのですよね。 Plotしたときにきちんと面積を囲めば、バックグラウンドは差し引かれると思うのですが。

ウェスタンのImageJでの解析について 削除/引用 No.51-1 - 2011/02/21 (月) 03:39:04 - ImageJ 初歩的な質問だと思いますがご容赦ください。 ウェスタンブロッティングでメンブレンからHRP試薬を用いてフィルムに感光して、ImageJで半定量を行っています。 同僚に教えてもらった方法は、 ・スキャナーで取り込んだfileを開く ・水平に並んだブロットを囲み、Crop ・Cropしたものを、Invertで白黒反転 ・Brightnessで明るさを調節 ・ブロットを一つ一つ囲む ・上記の方法で得られたブロットのMeanを同様の方法で得られたControlのMeanで割った数値を用いる という方法で行っています。 少し調べたらbackgroundの値を引くなどの記載があったりするのですが、具体的なやり方がわからず結果に不安があるので質問をさせていただきました。 詳細に教えていただけると嬉しいです。

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