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(無題) 削除/引用 No.509-7 - 2011/06/13 (月) 16:23:42 - 293T 返事ありがとうございます。 保存中に、問題があると思ったいきさつは、 培養系に変化（血清ロット、培地）に変更点がないからです。 一度、他の人等に分けてもらいトライしてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.509-6 - 2011/06/13 (月) 10:49:51 - ~ 293T以外でもトランスフェクション効率が悪くなることはあるので、 性質の変化というのはおそらくはLarge T抗原の抜け落ちだけに起因するものでは無いと思います。 >保存中の問題かな >ストック中に性質が変化 原因を保存中に求めたいのは、何か理由があるのでしょうか。 保存中に何か起きた可能性を否定するデータはありませんが、 最後にトランスフェクションをしてからストックまでの間に性質が変化した可能性は捨てられませんし、 起こした後でも、血清ロットが悪かったなどで性質が変わることもあるでしょう。 >別のロットの細胞を起こしましたが、結果は同じです。 これは、起こした後の培養・トランスフェクション条件が悪いともいえますよね。 （同じタンクで保存していて、同じように性質が変わったと言えなくもありませんが） 別の液体窒素タンクに保存されていた細胞や、他の人・ラボの細胞を少し分けて貰って試してみることは出来ないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.509-5 - 2011/06/12 (日) 07:41:28 - 半年 私の場合、293Tを半年ほど、Neoなしで飼ってますけど、問題ありません。 ほかのセルでコントロールを取り、悪いなら、あなたのトランスフェクションの系のどこかが悪い、損傷しているということでしょう。

(無題) 削除/引用 No.509-4 - 2011/06/11 (土) 12:56:38 - 293T 返事ありがとうございます。 細胞ですが、ネオマイシンセレクションをしましたが、 問題なく増殖しています。 しかし、導入がうまくいきません。 また、別のロットの細胞を起こしましたが、結果は同じです。 ストックを作製する前は、非常に導入効率は高かったです。リン酸カルシウム法では、９０％はいっていました。 ストック中に性質が変化することはあるのでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.509-3 - 2011/06/10 (金) 16:14:12 - ~ 細胞を飼い続けたりすると、性質が変わって入りにくい細胞になることがあります。 そのストックは、作られる前の時点では導入効率がよかったのでしょうか？ 可能であれば、別のロットの凍結ストックを試してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.509-2 - 2011/06/10 (金) 15:25:36 - おお 抜けたというのは100%否定できるものではありませんが、まずないでしょう(がん遺伝子で増殖に有利に働くという観点から余計に)。T-antigenはネオマイシンのセレクションマーカーで導入していますのでネオマイシンをつかってなければ、ネオマイシン存在下でしばらくかっておけば、抜けたやつがいるなら排除できるかもしれません。 親株293でもトランスフェクションの効率は非常にいいので、T-antigenが抜けていても導入効率はいいはずです。なのでトランスフェクションかT-antigen以外の細胞の調子が原因であろうとおもえます。GFPとかは同じ手法で非常によく発現するなら、導入した遺伝子の半減期が非常に早いとか、コンストラクとが効率よく発現しないなどの理由も考えられるかもしれません。

HEK293TのT-Large抗原の抜け落ち 削除/引用 No.509-1 - 2011/06/10 (金) 14:09:18 - 293T いつも参考にさせて頂いております。 HEK293Tについて、皆様に教えて頂きたいです。 HEK293Tにリン酸カルシウム法で遺伝子導入をしております。用途としては、一過性の発現とレンチウイルス作成です。最近、リン酸カルシウム法での遺伝子導入効率が非常に低く、困っています。試薬（2xHBS, 2.5MCaCl2)を作り直しても、全く変化ありません。pHも変化させ、多数のポイントで確認していますが変化がありません。 Fugene6等の試薬にした場合、遺伝子導入効率は上昇しますが、思ったほどではありません。 そこで、HEK293TのT-Large抗原が抜け落ちたと思ったのですが、 そのようなことってあるのでしょうか？ 新しい細胞ストックを使用しても同様な結果なので、保存中の問題かなとも思っています。 よろしくお願い致します。

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