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ゲルシフトアッセイのスーパーシフトに関して トピック削除
No.507-TOPIC - 2011/06/09 (木) 23:15:17 - TH
ゲルシフトアッセイについて初歩的な質問です。
ある論文においてDNA結合タンパク質(転写因子)に対する抗体を加えてスーパーシフトを確認しているfigureがあるのですが、たいていDNA-タンパク質-抗体複合体は移動度が遅延するはずですが、遅延することなくただ複合体のバンドが薄くなっているだけでDNAとタンパク質が結合していると判断している結果があります。
このようなことはあり得るのでしょうか?あり得るのであればどういう解釈をすればよいのでしょうか?
　
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No.507-6 - 2011/06/18 (土) 02:07:10 - おお
>[Re:5] Actiasさんは書きました :

> ゲルシフト出使った（バンドが消える）抗体でChIPアッセイをしていて、PCRのバンドが見えるなら、うそっぽい。「蛋白質とDNAの間に割り込む抗体を使って落ちてくるものにDNAが含まれている絵」が思い浮かばないです。

理屈はわかります。ただ否定できるとまではいえませんよね。ChIPアッセイは方法によりますけどクロスリンク後1%のSDSで変性させて抗体に影響ない濃度まで希釈してIPするプロトコールもありますのでIPのときにすでにDNAに接触していた部分は変性によって離れてしまってるかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.507-5 - 2011/06/17 (金) 23:29:31 - Actias
スーパーシフトというのは、抗体を加える操作を言うのでなく、加えた結果として移動度が遅延することです。
抗体を加えてバンドが消えたというのは、たとえば転写因子のDNA結合部位に抗体がくっついて、結合できなくした場合などが考えられます。でも、これはスーパーシフトとは呼びません。抗体によるDNA結合の競合阻害です。

ゲルシフト出使った（バンドが消える）抗体でChIPアッセイをしていて、PCRのバンドが見えるなら、うそっぽい。「蛋白質とDNAの間に割り込む抗体を使って落ちてくるものにDNAが含まれている絵」が思い浮かばないです。

(無題) 削除/引用
No.507-4 - 2011/06/10 (金) 09:17:07 - TH
おお様
K様

ありがとうございます。
スーパーシフトというのは単に移動度が低くなることではないのですね。
具体的に申し上げますと、あるプロモーター配列にCREB1が結合しており、その抗体を加えることでその移動度が低くなっている結果と、
それに対してプロモーターにATF-2も結合しており、その抗体を加えることでバンドが消失している結果が隣り合わせにあって混乱してしまいました。
ATF-2のほうは抗体との結合によってプロモータへの結合活性が失われたためという解釈でよろしいでしょうか？
あとゲルシフトアッセイの次にChIPアッセイをしてプロモーター配列に結合することを確かめているので間違いないですね。。

ちなみに論文はNeville J. Butcher et al., 78 503-510 2010 figure 3Cです。。

(無題) 削除/引用
No.507-3 - 2011/06/10 (金) 06:13:16 - k
http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=255

(無題) 削除/引用
No.507-2 - 2011/06/10 (金) 06:07:29 - おお
確かスーパーシフトの実験をすると、結合活性が失われバンドか消失する事があり、それは何か名前がつけられていたような気もしますが思い出せません。なのでスーパーシフトというのは正確な解釈ではないですが、バンドが特異的であるという解釈はいいと思います。

サイトカインでいう中和抗体のような感じの活性だと思ってください。

ゲルシフトアッセイのスーパーシフトに関して 削除/引用
No.507-1 - 2011/06/09 (木) 23:15:17 - TH
ゲルシフトアッセイについて初歩的な質問です。
ある論文においてDNA結合タンパク質(転写因子)に対する抗体を加えてスーパーシフトを確認しているfigureがあるのですが、たいていDNA-タンパク質-抗体複合体は移動度が遅延するはずですが、遅延することなくただ複合体のバンドが薄くなっているだけでDNAとタンパク質が結合していると判断している結果があります。
このようなことはあり得るのでしょうか?あり得るのであればどういう解釈をすればよいのでしょうか?
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