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ssDNA標識男 削除/引用 No.504-4 - 2011/06/09 (木) 20:49:45 - ssDNA標識男 早速のご返答ありがとうございます もう一点教えてください Biotin 3' End DNA Labeling Kit (Pierce社）からの製品はいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.504-3 - 2011/06/09 (木) 18:26:50 - あかね 03. Lambda Exonuclease treatment a. nuclease treatment ex)2 ug of dsDNA 5 ul of 10x buffer 0.8 ul of 5U/ul lambda ExNuc (NEB) ---------------------------------------------------- total 50 ul37C for 30 min 2 IU Lambda ExNuc. / 1 ug of DNA b. inactivate at 75C for 10 min c. Purify with Qiaquick PCR purification kit. Elute with 20 ul of H2O. d. Quantify the amount of DNA. *Digestion of 2 ug of dsDNA yields 1 ug of ssDNA. e. Quantify the labeling efficiency.

(無題) 削除/引用 No.504-2 - 2011/06/09 (木) 18:25:44 - あかね いろんな方法をためした結果以下の方法が、一番再現よく、収量もよくお気に入りです。 dsDNAをPCRをラベルして、いらない方のStrand(末端がリン酸化されたstrand)をNucleaseで特異的に分解する方法です。 Good luck Preparation of single strand long DNA probe 01. Phosphorylation of oligonucleotide a. 5' phosphorylation Mix following mixture 2 ul of 100 uM oligonucleotide 4 ul of 10 x Kinase Buffer A 4 ul of 10 mM ATP 2 ul of 10 U/ul T4 PNK (Nippon Gene) 28 ul of H2O --------------------------------------- total 40 ul Incubate it at 37C for 60 min. add 2 ul of 100 mM DTT (final 5 mM) Incubate it at 37C for 60 min. b. Purify oligonucleotide with MicroSpin G-25. c. EtOH precipitation d. dissolve the precipitant with 20 ul of H2O (final 10 uM). 02. Probe Amplification by PCR a. direct labeling by PCR 2.5 ul of 10 x ExTaq buffer 1 ul of 2 mM dNTP mixture ** (2 mM dA, dG, dCTP and 1 mM dTTP) 1 ul of 1 mM Biotin-16-dUTP (Roche) 2 ul of 10 uM 5' P-primer 2 ul of 10 uM ICON primer 0.5 ul of ExTaq 1 ul of template DNA 15 ul of H20 ---------------------------------------- total 25 ul / 40 cycle yield: ~ 1.5 ug / 25 ul reaction incorporation efficiency : Biotin-14-dCTP (invitrogen) << Biotin-16-dUTP (roche) b. Purify with Qiaquick PCR purification kit. Elute with 30 ul of EB c. Quantify the amount of DNA.

ｓｓDNAの標識 削除/引用 No.504-1 - 2011/06/09 (木) 17:43:33 - ｓｓDNA標識男 ssDNAの蛍光標識を行ないたいと思っています 何かいい方法をご存知でしたら、ご教授ください ちなみに相補鎖の利用以外を検討しています たとえば、たんぱく質の標識に用いられるFITCのようなもの よろしくお願いします

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