Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

最新のフォーラム　|　このフォーラム　|　ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

酵母でのプラスミドシャッフリング トピック削除
No.495-TOPIC - 2011/06/08 (水) 18:59:25 - ふじお
酵母(Saccharomyces cerevisiae)のゲノムにある遺伝子のドミナントネガッティブ変異（ポイントミューテーション）を導入したいと考えています。　指導者からプラスミドシャッフリングという方法があるからそれを用いてやってみたらといわれています。　しかし、指導者も含めて酵母の手法にそれほど詳しい人が一人もおらず困惑しています。　どなたかご教示いただけると幸いです。　

　まずURA遺伝子を含むPCR産物を用いて組み換えを行いUra(-)でセレクトしてKOを作る。　このKO細胞に変異を持つ目的遺伝子を含むPCR産物で再度組み換えを行い5Foaでセレクトしknock inを取得するという計画を立てています。　

ここで疑問ですが、酵母は2倍体ですのでスプラウトさせて一倍体でknockoutやknockinの操作をしないといけないのでしょうか？（スプラウト自体、当方全くやったことがありませんし、指導者も知らないらしいです。手法自体は適当にメソッド本を見てやろうかと思っています。）
それとも、形質転換後、栄養セレクトした後に再度スプラウトさせてホモKOやホモKnock-in状態にしないといけないのでしょうか？

たぶん酵母の操作においては凄く基本的なことだと思うのですが、身近に聞ける人がいなくて困っています。　どなたか以上についてアドバイスいただけると幸いです。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 解決済み 削除/引用
No.495-5 - 2011/06/10 (金) 17:50:13 - ふじお
弘法様
ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.495-4 - 2011/06/10 (金) 07:24:41 - 弘法
解決したようで良かったです。Welcome to the club!

ありがとうございます。 削除/引用
No.495-3 - 2011/06/09 (木) 03:06:50 - ふじお
ご返事ありがとうございます。

自身の無知や誤解を知り恥ずかしいばかりです。

＜質問１＞
SGDによると目的遺伝子は酵母の生存に必須ではないことが分かっています。
EuroscarfからのKO細胞を持っていますが、マーカーはKanaMaxでした。

＜質問２＞
すみません。持っている酵母はMat alphaの一倍体でした。
馬鹿でした。

ということは
胞子形成（スポルレーション）は必要ないので組み換えのトランスフォームを2回ほどするだけですね。
ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.495-2 - 2011/06/08 (水) 21:16:09 - 弘法
いろいろと誤解があるようです（スプラウトって？）。

まず、挙げておられる方法はプラスミドシャッフリングではありません。それはともかく、その方法でも望む変異株を得ることは可能です。ただし、問題の遺伝子産物が生育に必須でない場合に限ります（そうなのですか？質問１）。

ところで、「酵母は2倍体ですので」とお書きになっていますが、扱っておられる株は本当に2倍体なのでしょうか（質問２）。特殊な酵母を使っている訳ではないのであれば、1倍体の株から出発すれば良いように思います。もし、どうしてもその2倍体を使いたいのであれば、胞子形成（スポルレーション）を誘導する必要があります。方法はCurrent Protocols in Molecular Biologyにありますし、Googleで"yeast sporulation protocol"と検索すればいくつか出てきます。

どのような誤解をなさっているかに依ってお答えも違ってきますので、ひとまずトピ主さんからの回答を待ちたいです。

酵母でのプラスミドシャッフリング 削除/引用
No.495-1 - 2011/06/08 (水) 18:59:25 - ふじお
酵母(Saccharomyces cerevisiae)のゲノムにある遺伝子のドミナントネガッティブ変異（ポイントミューテーション）を導入したいと考えています。　指導者からプラスミドシャッフリングという方法があるからそれを用いてやってみたらといわれています。　しかし、指導者も含めて酵母の手法にそれほど詳しい人が一人もおらず困惑しています。　どなたかご教示いただけると幸いです。　

　まずURA遺伝子を含むPCR産物を用いて組み換えを行いUra(-)でセレクトしてKOを作る。　このKO細胞に変異を持つ目的遺伝子を含むPCR産物で再度組み換えを行い5Foaでセレクトしknock inを取得するという計画を立てています。　

ここで疑問ですが、酵母は2倍体ですのでスプラウトさせて一倍体でknockoutやknockinの操作をしないといけないのでしょうか？（スプラウト自体、当方全くやったことがありませんし、指導者も知らないらしいです。手法自体は適当にメソッド本を見てやろうかと思っています。）
それとも、形質転換後、栄養セレクトした後に再度スプラウトさせてホモKOやホモKnock-in状態にしないといけないのでしょうか？

たぶん酵母の操作においては凄く基本的なことだと思うのですが、身近に聞ける人がいなくて困っています。　どなたか以上についてアドバイスいただけると幸いです。
全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。