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おお 削除/引用 No.493-28 - 2011/06/09 (木) 12:41:46 - しぐれ シーケンス用に作ったプライマーで分かっている配列中で、より上流部分を読むようなものを2つ作りました。 その外側にあるプライマーを1st、内側にあるプライマーを2ndとしてカセットPCRにかけようと思いますが、それはおお様がおっしゃていることから外れているでしょうか？ また、Inverseでやる場合は、読みたい配列付近を切断するような制限酵素でPCRを行えばよいのでしょうか？ 何も分かっておらず、質問攻めですいません。 ゲルろ過でのことも気をつけたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.493-27 - 2011/06/09 (木) 12:27:49 - おお 多分複数回答がついているのでおきずきとおもいますが、150とか読めないとこの手前と反対側のおしり(今使っているプライマー)でPCRすれば必要なところだけを増幅できるでしょうし、それのほうがやりやすいと思います。 Inverseも手法的にワークしていてやりやすいのであれば、分かっている配列から読みたいところが狙えるような制限酵素を選びPCRを行えばいいと思います。 ゲル濾過は小さいフラグメントを除くには有効ですが、4kbpより3kbp、2kbpと短くなるほうが優先してベクターに入るだろうと言うことを１度考慮に入れるべきと思います。

〜様へ 削除/引用 No.493-26 - 2011/06/09 (木) 12:07:51 - しぐれ 目的は配列を読むことです。 おっしゃるとおり、読みたい手前の配列までは情報を持っています。 読めた部分のプライマーを設計してサイクルシーケンスしたのですが、続きが読めませんでした。 ABIのサポートにデータを送って聞いたところ、部分分解なので、短い配列が増えていて、読みたい配列の増幅効率を悪くしているのではないかということで、ベクターに組み込んで単一化しようと試みました。 また、ゲル抽出が出来れば綺麗に読めるのではないかと思い、こちらに投稿させて頂きました。

最初のほうに書かれていますが 削除/引用 No.493-25 - 2011/06/09 (木) 11:48:00 - ~ 目的はクローニングではなく、配列が読めない150bpを読むことなのでしょうか。 >プライマーからある程度は読めるのですが、開始コドンや転写開始点まであと150塩基が読めません。 少なくとも、プライマーを使ってある程度の部分を読めるだけのテンプレートと、読みたいところの手前までの配列情報を持っているのですよね。 その読めた配列部分にプライマーを設計して、手持ちのテンプレートをサイクルシークエンス法で読めば、続きが読めますよね。

ンンノ様へ 削除/引用 No.493-24 - 2011/06/09 (木) 11:34:33 - しぐれ 文章が下手で申し訳ありません。 解読できています。 PCRをかけてみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.493-23 - 2011/06/09 (木) 11:23:50 - ンンノ ちょっと文章がよくわからないんですが、４０００ｂｐの配列解析で、残りが １５０ｂｐなら３８５０ｂｐは解読できてるってことですよね？ 未解読部分の直近にプライマーを設計してPCRして配列を読めばいいじゃない でしょうか。

し様へ 削除/引用 No.493-22 - 2011/06/09 (木) 11:15:20 - しぐれ ゲルろ過で小さめのフラグメントを取り除くほうがゲル抽出よりも効率がよいでしょうか？ 自作も出来るようなので調べてみたい思います。

おお様へ 削除/引用 No.493-21 - 2011/06/09 (木) 11:11:39 - しぐれ ゲル抽出後に、抽出できているか確認の泳動をしたのですが、確認できませんでした。 濃度は3μgを入れて抽出したつもりでしたが、正確ではないです。（ご指摘頂いたような理由から） Inverseは試したのですが、お尻の配列を読んでいたのでこちらに変更しました。(Not1とBgl2）　 確かにあと150塩基ほどなんですが、4000bpからどうやって小さくすればよいのでしょうか？ 制限酵素で切断しても4000bpから小さくなりませんでした。

(無題) 削除/引用 No.493-20 - 2011/06/09 (木) 11:00:30 - おお ん、あと150塩基なら4kbp丸ごとクローニングする必要ないじゃん。

(無題) 削除/引用 No.493-18 - 2011/06/09 (木) 06:47:35 - し >あと150塩基が読めません。 もう一息なのですか？頑張ってください！ アガロースゲル電気泳動をせずに、CHROMA SPINとかcDNA サイズ分画カラムとか言ったゲルろ過カラム（自作も楽しいかも）で小さめのフラグメントを取り除くだけして、次のステップへ進んでみるというのはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.493-17 - 2011/06/09 (木) 06:01:39 - おお TAで必要な量というと最終的に50ng位とれれば十分ベクターに組み込めると思います。PCRがあまりうまくいっていないのがちょっと厳しいですね。きれいにかかっているようなPCRでも溶液をエタチンなどしてみるとメインなバンドのほかに若干スメアなシグナルとか、短いフラグメントなど目立ってくるのは確かです。 結局フラグメントがゲルから抽出できなかったと言う事でしょうか?濃度はどれくらいでしたか?電気えいどうで確認されましたでしょうか? 電気えいどうで十分確認できるなら、制限酵素処理などして予想どおりにきれるか確認するてもありますが、配列が決まってないのですよね。 ちょっと作戦を変更してゲノム(ゲノムでしたよねサンプルは)を制限酵素処理、ライゲーションしInverse PCRを行った方がいいような気がしてます。 http://en.wikipedia.org/wiki/Inverse_polymerase_chain_reaction

(無題) 削除/引用 No.493-16 - 2011/06/08 (水) 21:51:00 - しぐれ よく分かっておらずすいません。 それはどのように組み合わせるのでしょうか？ nastedを2段階やって温度を振ったりしても増えず、カセットでは増えたので単純にそれのシーケンスを読みました。

(無題) 削除/引用 No.493-15 - 2011/06/08 (水) 21:15:59 - AP どういう手順を踏んだのかはわからないですが、 >nastedはやったんですが、上手く増えず、カセットに変更しました。 nested PCR　とcassette PCRは排他的ではないですが。 特にcassette PCRをやるとき、nested PCRを組み合わせることは多いです、ということを念のため申しておきます。

APさまへ 削除/引用 No.493-14 - 2011/06/08 (水) 20:48:05 - しぐれ nastedはやったんですが、上手く増えず、カセットに変更しました。

(無題) 削除/引用 No.493-13 - 2011/06/08 (水) 20:30:30 - AP >プライマーの位置を変えてもだめでした。 nested PCRなんかは試してみましたか？

ありがとうございます。 削除/引用 No.493-12 - 2011/06/08 (水) 20:26:06 - しぐれ APさま> やはり正確ではないのですね。おっしゃられた方法をやってみたいと思います。 そういわれると濃度もおかしいと思います。 バンドも細くて薄いのですが、キットのPCR条件で、温度を高くしたりサイクル数を変えたりしたのですが、改善されませんでした。

ありがとうございます。 削除/引用 No.493-11 - 2011/06/08 (水) 20:20:59 - しぐれ シーケンスで読みたかったのですが、短い配列が増えてしまって増幅効率が悪くなっていて上手く読めないのだろうとABIの方にアドバイスを頂きました。そこで一度ベクターにクローニングして単一化しようと試みました。 プライマーからある程度は読めるのですが、開始コドンや転写開始点まであと150塩基が読めません。途中からピークがかなり低く全く読めなくなります。 色々ABIの方に聞いて工夫したのですが、読める距離は改善されませんでした。プライマーの位置を変えてもだめでした。 濃度もおっしゃるとおり、正確ではないのでもっと少ないのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.493-10 - 2011/06/08 (水) 20:18:04 - AP >PCR産物をEtOH後、ナノドロップで測定し、600ng/μLだったものを5μL入れたので約3μLとしました。 ふつうにEtOH沈殿してもフリーのdNTPやプライマーはあんまり取り除けないので、それらが吸光度を底上げしていると思います（もちろん短い産物やスメアも同様ですが）。電気泳動してEtBr染色による、比色法で量を見積もるほうが適当です。 どういうシステムでPCRしたのかわかりませんが、だいたいからして一反応のPCRで得られる産物はせいぜい1 ugなので、600 ng/ulなら1 uLで全収量に相当するくらいで、まず、果たしてそんなに大量のPCR産物が本当にあるんだろうかと疑問に思います。 あと、短い産物やスメアが、目的の産物より濃いというのは別の意味問題が大きいと思います。

(無題) 削除/引用 No.493-8 - 2011/06/08 (水) 19:10:31 - ンンノ カセットPCRではないですが、ちょっとトリッキーなゲノムPCRの産物を鋳型に して日常的にシーケンスを解析しておりました。 サイクルシーケンシング反応はPCRとは違いますが、検出系も洗練されていて 感度が高いので、EtBｒで染まるくらいのDNAがあれば十分に配列解析が可能 です。 ただしUVによるDNAのダメージはとても大きいので、そこだけは用心していました。 クローニングするよりは、一部でも新規に確定した配列に基づいてPCRプラ イマーを設計して、通常のゲノムPCRでウォーキングするほうがいいような 気がします。 それから、 EtOH沈殿は未反応のｄＮＴＰも落ちてくるので、その方法ではDNA濃度測定を 誤ってるかもしれませんね。

わざわざありがとうございます。 削除/引用 No.493-7 - 2011/06/08 (水) 18:17:10 - しぐれ さくさま> 色々調べてみます。 バンドもあんまり濃く出ないので、レーン数を増やしてみたいと思います。

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