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(無題) 削除/引用 No.485-3 - 2011/06/06 (月) 16:48:10 - おお >[Re:1] しぐれさんは書きました : > > �@LA PCR in vitro cloning kitで増幅している産物は組み込めるか？ http://www.takara-bio.com/lapcr/chapter5-14.htm おそらく大丈夫でしょうね。プライマー5'エンドの塩基の種類によってAのつきかたなど若干違いがあるようですが、ちょっと今具体的に思い出せません。ただTAクローニングようのキットのマニュアルのプライマーデザインの項目でそれを具体的に書いてないので神経質にならないでいいのかもしれません。 > 　また、カセットプライマーを使用しているが、インサートチェックの時のP　CRをどのようにかければよいか？ 直接ミニプレップで良いのではないでしょうか。500bp以下のプロダクトができるようにベクターないのプライマーとインサートのプライマーのペアーを作ることも考えられますが、得られるものはヘテロでバリエーションがおおく数こなしたいのでなければ、わざわざPCRでチェックする必要性は感じません。方向を気にしないならなおさらです。内部配列だけが増えるようのPCRというてもありますが場合によってはフォールスポジティブを拾いやすくなります。直接ミニプレップでプラスミドを得てベクターのマルチクローニングサイトにある制限酵素でインサートを切り出してサイズを確認してください。得られるののの配列が一部不明であって使った酵素で切れても、ベクターと重ならない限り大体必要なサイズのインサートがあるかどうかは分かるはずです。 > �A形質転換する大腸菌はキットで推奨しているものがよいのか？ PCR産物との相性が若干ありますが、たいていサブクローニングで使っているいっぱんてきな大腸菌であればほぼ大丈夫だと思います。ただしTAクローニングベクターに自殺遺伝子など仕組んでいるような場合はベクターとの相性を考える必要があるかもしれません。 > > インサートを入れるコツなど、プロトコールで注意することも合わせて教えてください。よろしくお願いします。 PCRプとダクトはなるべくアガロースで電気えいどうして、目的のサイズを切り出すこと。プライマーダイマーや検出できなくても何らかのノンスペが微量でもPCRで増えていたら、特に目的のサイズが大きいので小さいフラグメントが微量でも存在すると可也不利です。同時にノンスペを減らすために最小限のサイクル数やできるだけ高いアニーリング温度をつかう(ただこれはキットを使っているので制約があるかもしれませんし、それでクローニングができるならたぶんノンスペはきっとの条件で抑えられているのだと思いますが)。 電気えいどうできりだすときUVをあてない(これは何どもここで出てきていますので検索などで見つかると思います。銀紙でさえぎってレーンのごく一部しかあてないとか検出用のレーンと抽出用のレーンを用意しておいて、検出用のレーンだけUVをあてて抽出用のレーンの同じポジションを切り出すとか)。 ベクターだけのらいゲーションでネガコンをおく。ネガコンより数倍でもおおくクローンが得られていれば来ゲーション自身はうまくいっていると評価できるので、その状態で使ったフラグメントがちゃんとしたものであればほぼ成功していると考えて良いのではと思います。

(無題) 削除/引用 No.485-2 - 2011/06/06 (月) 16:37:02 - クロレッツ ２の質問についてですが、 インビトロジェンに限らず海外から輸入しているコンピテントセルは 空輸の段階で効率が低下すると考えられているため、当方ではTOPO cloningをしたプラスミドの形質転換には日本製のコンピ（Takara DH5α）を用いています。 これで一定の割合で取れていますので、コンピについてはキットの推奨にこだわる必要はないと思いますよ。詳細を知りませんので、参考程度までに。 １の質問についてはよくわからないので、これにて失礼します。

TAクローニングについて教えてください。 削除/引用 No.485-1 - 2011/06/05 (日) 01:15:55 - しぐれ 現在、部分分解してからLA PCR in vitro cloning kitで増幅した4000bpのPCR産物の配列を読んでいますが、シーケンス反応の効率が悪く、うまく読めないので、一度ベクターにクローニングして単一化してから読もうと思っています。 そこでinvitrogenのTOPO TA Cloning Kitを使いたいのですが、いくつか知りたいことがあります。自分なりに調べてみたりはしたのですが、よく分からなかったのでこちらで質問させていただきます。勉強が足らないことはよく分かっています。よろしくお願いいたします。 �@LA PCR in vitro cloning kitで増幅している産物は組み込めるか？ 　また、カセットプライマーを使用しているが、インサートチェックの時のP　CRをどのようにかければよいか？ �A形質転換する大腸菌はキットで推奨しているものがよいのか？ インサートを入れるコツなど、プロトコールで注意することも合わせて教えてください。よろしくお願いします。

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