BioTechnicalフォーラム [Taq Polymeraseと遺伝子クローニング]

Taq Polymeraseと遺伝子クローニング

No.481-TOPIC - 2011/06/03 (金) 23:38:27 - ポリメラーゼ

初歩的な質問です。もし、前のフォーラムなどに既出でしたら申し訳ありませんが、そのURLを教えていただけると嬉しいです（自分では検索したつもりなのですが・・・）。

リコンビナントタンパクなどを作るときに目的遺伝子をクローニングしますが、この時普通はPfuやKODなどのFidelityの高いものが使用されます。
Fidelityが高い方が良いのはわかるのですが、仮にTaqを使用した場合、そんなにもエラーや変異が入るものでしょうか？個人的には、KODで増幅しなかった時に何度かTaqで増やしたことがあるのですが、エラーが入ったコンストラクトができたことはほとんど無いのですが（１，２度はあります）、皆さんやはりTaqを遺伝子クローニングの用途に使用されることはありませんか？
経験談などお聞かせいただけると嬉しいです。
　

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No.481-5 - 2011/06/04 (土) 04:07:18 - 310

TaqのFidelityはPCRの条件によって変わります。過剰なTaqや高濃度のdNTPはTaqのFidelityを低下させると、依然持っていたマニュアルに書いてありました。変成剤も変異を上昇するようで、LA-TaqとGCバッファーでクローニングしたところ、２つの遺伝子のうち一つでは、おお様の言う300bpに一つの割合でアーティファクトらしき変異が見られました。もう一つも変異はありましたが、１kbに一つより少し少ない程度でした。TakaraによるとLA-Taqは通常ではTaqよりFidelityが高いが、GCバッファーを使うと通常のTaq並になるとのことでした。

今はINVITROGENのPlatinumTaq-HFとTakaraのPrimeStarHSを使い分けております。PrimeStarHSはアニーリング効率が上昇するため、TaqのPCRサイクルを用いてPCRを行いたい、またはアニーリングを厳格にしたい時はPlatinumTaq-HFを、長い配列やGC-richな配列は校正活性を持ち、GC-bufferをつかってもFidelityが落ちないPrimeStarHSを使っております。

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No.481-4 - 2011/06/04 (土) 02:28:59 - おお

小出しですいません。経験ということであればやった事はあります。よく入る時は300bpに一個とかでしょうか。1kbpで入ってなかったこともあります。300に一個だと1kbpで平均3つ。変異がないのを取るのが難しくなってきますね。

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No.481-3 - 2011/06/04 (土) 02:25:11 - おお

Taqでやるのはダメだという通説はないと思います。変異の頻度を考えるとクローン数を稼がないといけないかもしれない(特に長いやつでは)。または長いものであれば場合によっては2つのクローンから正しいとこを切り出してキメラにするとか手間がかかる場合がある。そんなところでしょう。

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No.481-2 - 2011/06/04 (土) 01:05:10 - 774

ターゲットの大きさ次第な感じです。