BioTechnicalフォーラム [DNAのリニアライズについて]

DNAのリニアライズについて

No.480-TOPIC - 2011/06/03 (金) 15:09:39 - kit

いつも参考にさせて頂いております。
DNAのリニアライズについてご意見を伺いたいと考え、スレッドを立てさせて頂きました。
現在、KOマウス作成のためプラスミドをリニアライズしてES細胞へelectroporationを行おうとしているのですが、リニアライズする際に切れ残りのpDNAが多く、完全なlinear DNAが調整できません。具体的な実験条件としましては35 ug(約13 kbp）のpDNAに50 U/5 ulのClaI（Takara製）とM bufferを加え、400 ulのvolumeで37度, overnightで反応させました。切ったDNAを電気泳動しますと13 kbpと9 kbpのあたりにバンドが1:1の割合で検出されました。その他のバンドは見られないことからdouble digestionは起きておらず、単純に切れ残りのpDNAが9 kbpの所に検出されていると解釈しております。またClaIのサイトにメチル化が起きないように設計してあります。
SacII（NEB製）でも同様の条件で試しましたが全く同じ結果でした。その他のコンストラクト（同じベクターをtemplateにして設計しました）では問題なくリニアライズ出来ていることからインサートの配列が何らかの阻害効果を持っているか、もしくはDNAの精製が悪く、何らかの阻害物質がコンタミしていると考えております。なおDNAの精製はNucleo Bond（Takara製）を用いております。DNAを再精製するか、一度切ったものをエタ沈後にもう一度切ってみるなどの条件検討を考えているのですが、それでも上手くいかない場合はコンストラクトの再設計を行うしかないでしょうか？
周囲の教官や先輩方に尋ねましたが同様の経験は無いようで首をかしげております。また制限酵素はClaIかSacIIしか使えないため困っております。
ご指摘、ご助言等頂ければ幸いです。よろしくお願い致します。
　

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No.480-6 - 2011/06/04 (土) 12:11:20 - kit

APさん、~さん
ご返信ありがとうございます。
確かにovernightの反応ということで条件を甘く考えておりました。
酵素量の増加も検証してみます。
今後もよろしくお願い致します。

(無題)

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No.480-5 - 2011/06/03 (金) 23:29:07 - AP

制限酵素量の不足の可能性はあると思います。

一般的にlambda DNA 1 ugを1時間で完全消化する酵素量を1 unitとして定義されています。しかし、多くの酵素は、同じ条件では高次構造をとるスーパーコイルDNAを完全消化できず、より多くの酵素量が要求されます。どれくらいの過剰量が必要かは酵素によって違いますが、カタログなどに情報があります。
たとえば、
http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?catcd=B1000359&subcatcd=B1000360&unitid=U100002662

これによれば、ClaIで1 ugのプラスミドを完全消化するのに、10 units (酵素量10倍）で2時間（処理時間2倍）必要です。つまりlambda DNAを切る場合の10 x 2=20倍過剰の条件が必要ということです。さらに、酵素の効き具合はDNAの精製度の影響を受けるので、自前で精製したプラスミドはさらに過剰の消化条件が必要になることが珍しくないです。

また一般に酵素量の不足は、反応時間の延長で相殺することができるとされています（酵素量が半分にしたら、反応時間2倍にすれば同等の結果）。しかし、酵素の安定性、酵素活性の半減期が酵素ごとに異なり、短時間で失活する酵素では、反応時間の延長するにも制限があります。たとえば、ある資料によるとClaIの酵素活性は8時間が限度です。また、至適温度は30℃程度となっているので、37℃の反応だとさらに失活が早まるかもしれません。

以上考え合わせると
>35 ug(約13 kbp）のpDNAに50 U/5 ulのClaI（Takara製）とM bufferを加え、400 ulのvolumeで37度, overnightで反応
と言う条件は、かなりぎりぎりかそれ以下の線じゃないでしょうか。

なお、BamHIは高次構造に強いので、スーパーコイルも容易に切れます。BamHIが効いてリニアになれば、ClaIも普通に効くので、
>プラスミドに関しましては精製後にClaI+BamHIで切りましてインサートの確認をしております。その際にはインサートのバンドがはっきりと見えまして、そこまで切れ具合が悪いという印象ではなかったのですが、
そういうことがあって不思議はないです。

(無題)

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No.480-4 - 2011/06/03 (金) 18:40:05 - ~

もう済みになっていますが、
>13 kbpと9 kbpのあたりにバンドが1:1の割合で検出されました
半分は目的のフラグメントだというのであれば、
2倍量切れば必要量が得られますよね。

再精製でも現象が変わらなければ、力技で次のステップに進んだほうが効率がいいかもしれません。

(無題)

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No.480-3 - 2011/06/03 (金) 17:05:39 - kit

おおさん
早速のご返信ありがとうございます
プラスミドに関しましては精製後にClaI+BamHIで切りましてインサートの確認をしております。その際にはインサートのバンドがはっきりと見えまして、そこまで切れ具合が悪いという印象ではなかったのですが、ClaI単独ではよろしくないようです。アルカリ処理に関しましてはキットのプロトコルどおりですので大丈夫だと思っております。ご助言のとおり、再酵素処理とプラスミドの再精製を試してみます。

(無題)

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No.480-2 - 2011/06/03 (金) 15:45:07 - おお

サイトがあることが間違えないのであればエタチン再酵素処理も考えて良いと思います。プラスミド溶液になにか混じってるのかもしれませんが(アルコールとかグアニジン)そういう場合であればエタチンでまずOKかと思います。

精製純度が悪いとなるとむかしならフェノールやクロロフォルムを使うでしょうけど。カラム使って精製しているのであればまず大丈夫だと思いますけどね。

精製後は１度何か他の酵素で正しいプラスミドであることは確認されたんでしょうか?

あ、最初のアルカリ使う時にきつ過ぎるとなんか変なことがおこって酵素で切れなかったりすることがあるっていう話があったなぁ。。。その場合は大腸菌から精製しな押しでしょうかねえ、、、

DNAのリニアライズについて

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No.480-1 - 2011/06/03 (金) 15:09:39 - kit

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