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ありがとうございました。 削除/引用 No.464-4 - 2011/06/02 (木) 09:24:04 - たろうちゃん 　いろいろアドバイスありがとうございました。 　どうも精子のサンプルがクルードなのが原因ではと今は考えています。アプライ量を上げたり抗体濃度を上げるとうっすらバンドが出るようになりました。純粋な精子を回収するように努力してみます。 　この度は本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.464-3 - 2011/05/31 (火) 08:12:54 - JH 精子にはアクチンは微量しか含まれておりませんので、westernをしてもバンドは出ないと思います。tubulinの方は他の臓器以上にはっきり出ます。 プロトコールとしては、超音波破砕＋1% SDSでの可溶化程度で十分出てくるはずです。詳細は分かりませんが、大まかには書かれた手法で特に問題はないような気がします。

(無題) 削除/引用 No.464-2 - 2011/05/31 (火) 01:19:17 - おお 銀染色でしかバンドが確認できませんですか? 収量は大丈夫なのか気になります。もともと殆ど余分なタンパクを持たないのでたの細胞と同じ比率でバッファーを加えていると総タンパク量として少ないかもしれません。細胞数あたりで見たいということであれば仕方ありませんけど。

精子のたんぱく質を用いたウェスタンブロッティングについて 削除/引用 No.464-1 - 2011/05/30 (月) 21:01:32 - たろうちゃん 　いつも勉強させていただいております。 　教えていただきたいのですが、哺乳類の精子からたんぱく質を抽出して、ウェスタンブロッティングをしておりますが、tubulinやactinなどポジティブコントロールと思われる抗体でもバンドがでません。別の場所からとったたんぱく質を用いると問題なくバンドがでるので、ウェスタンの手技は間違っていないと思います。また銀染色でもたんぱく質はちゃんととれていると思われます。 　そこで、どなたか精子からのたんぱく抽出方法に詳しい方ご教示いただけないでしょうか？ 　私の方法は、精液を回収してPBSなどで洗浄したあと、RIPA lysis buffer(santa cruz社製)を用いて冷やしながらけんだくして、超音波破砕をしてあとは遠心して上製を回収しています。RIPA bufferにはNP40やSDSも含まれています。 　よろしくお願いします。

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