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(無題) 削除/引用 No.443-7 - 2011/06/22 (水) 10:53:24 - 774 プライマーを３つ繋いだときのものより、数bpでも内側に設計すると効率がよくなることがあります。

(無題) 削除/引用 No.443-6 - 2011/06/22 (水) 10:39:06 - ~ 気になるのは ①テンプレート >３つのフラグメントをつなぐことができました。 これは、PCR後に泳動して、目的の位置にバンドが見えたということでしょうか？ 配列を読むか、最低でも制限酵素地図で目的のものであるかは確認しているのでしょうか。 実はアームの片方だけが2つ繋がったりして、同じくらいのサイズの目的のものとは異なるフラグメントだったりしませんか？ ②PCRの条件 アームが左右に2kbずつということは、4.5kb位はあるのでしょうか。 PCRの条件はどのあたりを振ってみたのでしょうか？ LA-taqを使っているのであれば、GC bufferも試してみてはいかがでしょうか。 ③断片の精製度 PCRのテンプレートであれば、切り出し時のUV照射の影響はほとんど無いと思います。 ただ、精製でPCRを阻害するようなものを残してしまっていれば、PCRがかからなくなるかもしれません。 精製後にどのくらい希釈しているか分かりませんが、MilliQ水等でpg/uLオーダーくらいには希釈しているのでしょうか。 PCRのテンプレートですから、不足よりかは持込の過剰を心配したほうがいいと思います。 ③目的は何？ PCRで増やすこと自体は目的ではありませんよね。 おそらくはターゲティングのために使うのでしょうか。 増やせている2nd PCRを数十本程度やって必要量のフラグメントが得られるのであれば、力技で必要量を取ってしまうのもいいかもしれません。 または、いったんTベクターに入れてしまってはいかがでしょうか。 制限酵素で切り出すのであれば更にアダプターを付けないと末端にゴミがつきますが、 PCRで回収するのであれば、Tベクターに入った状態でも出来ますよね。 配列も読みやすくなります。

(無題) 削除/引用 No.443-5 - 2011/06/22 (水) 09:26:26 - 学生 皆様のおかげで、３つのフラグメントをつなぐことができました。 しかしながら、３つの産物をつなげたものをゲルから抽出して、それを両端のプライマーで増幅しようと思っても増えませんorz 条件をいろいろふって検討したのですが・・・ ボスにも相談したのですが、よくわからないという結論になってしまいました。 どなたか経験談や、予想などあれば教えていただけませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.443-4 - 2011/05/26 (木) 12:57:47 - 学生 つたない文章ですみませんでした。。。 774さんのおっしゃった通りのイメージです。 PCR産物を結合させるときのイメージでやったので、プライマー量が少なかったかもしれません。 今、DNA濃度を測定する機械がうまく測れない状態なので、過去のトピックを参考に、100倍希釈したものを使っていました。 これでも2回目のPCR後バンドが見えたので、もとのものを使えば十分量でしょうか・・・ でも、もう１つ断片を作る方法も検討したいと思います。（今日また失敗したら） 今使ってるプライマーも無駄にならないですね。本当にすばらしい助言ありがとうございます！ ３つを結合させるなんてひらめきませんでした！ 何かありましたら是非、助言お願いします。

(無題) 削除/引用 No.443-3 - 2011/05/26 (木) 09:40:41 - 774 最終的なコンストラクトのイメージは”配列１ー蛍光タンパクー配列２”で、1st PCR産物が １．配列１+蛍光タンパクの頭 ２．蛍光タンパクのお尻+配列２ で、これをプライマーにして蛍光タンパクの発現ベクターを鋳型にPCRをする。 ということですかね？ 経験上、この時の重なりは22bpで問題ないと思います。 1st PCR産物のモル数はプライマーとして機能するような量に揃えてますか？ （かなりの量になりそうな気がします。） 僕だったら蛍光タンパクをPCRで増やして、3つの断片を混ぜて一番外側のプライマーで繋げます。

(無題) 削除/引用 No.443-2 - 2011/05/26 (木) 09:14:02 - dec 文面からではなにをやっているのかいまいちわかりません。 複数断片の方向性クローニングなら下記のような製品があります。 サンプルももらえると思います。 http://www.invitrogen.jp/cloning/geneart_Seamless.shtml

PCR産物でPCR 削除/引用 No.443-1 - 2011/05/25 (水) 21:36:04 - 学生 左右に2kbのアームがついた蛍光タンパク配列を含むフラグメントをPCRで作ろうと考えています。 簡単にいうと、１回目のPCR産物をプライマーのかわりにして２回目のPCRを行うつもりです。 過去のものでPCR産物同士を結合させるというものはあったのですが、少し違うので新たに質問させていただきました。 まず１回目のPCRではFはそのままのプライマーで、Rには次に結合させたい鋳型の最初の配列をつけて増幅します。 これを次に結合させたいもののFとRになるように増幅します。 これをゲルから抽出し、次に蛍光タンパクを含むベクターを鋳型にしてPCRを行います。 ゲルから抽出したもののみを使うパターンと、最初に使ったプライマーも入れる方法と検討しているのですが、うまく増えません… 酵素はタカラのLAtaqを使用し、２回目のPCRで結合する部位は22bpです（短すぎたかなと思っています）。 やったことがある方、何かアドバイスいただければ幸いです。

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