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(無題) 削除/引用 No.442-10 - 2011/05/28 (土) 03:43:13 - 310 短い断片が増幅されることから、プライマーがミスアニーリングをインサート内で起こしている可能性があります。インサート前のゲル抽出PCR産物とベクターのみをPCRすれば、何が起きているか分かるでしょう。 私はコロニーPCR用にはベクターのプライマーを使います。またコロニー内に存在するDNAseの不活化を変性剤条件化で95Cで行い、その一部をPCRしています。こうするとセルフライゲーションも含め、ほぼすべてのコロニーでバンドが出ます。またインサート事にプライマーが変わらないので、条件設定が比較的楽です（サイズに合わせた伸張時間の変化位です。）極端なGC-rich出ない限りDNAseの不活化の段階でDNAの変性が起きると思われるので、たいていの場合応用が可能です。内部のプライマーでは分からないことが多い重複インサートもはっきり検出できます。 またトランスフォーメーションが終わりプレートにまく直前に軽く遠心してLBで洗います。これでコロニーPCR擬陽性をほぼ消すことができました。それが面倒であれば、コロニーが生えた後、別のプレートに植え継いで生えてきたコロニーをPCRしても良いです。急ぐときには、大腸菌をまく前にLBで洗い、コロニーをチップで植え継いだ後、そのチップをDNA不活化溶液で洗っています。 上記の手法が面倒であれば、コロニーPCRに使うコロニーの量をできる限り少なくしてください。それだけで大分効率は変わるはずです。 DNAseの不活化はBiotechnic Vol29, No1(2000)p38-42を参考にしています。 ＋Aの効率はPrimer5'の配列に影響を受けます。元文献を忘れてしまっているのでバイオ実験イラストレイテッド”本当に増えるPCR”63ページのコラムを参考にしています。5'末端がT>G>C>Aの順で＋Aがつくそうです。 私は実際は、プライマー作成時にこの事を忘れてしまう事が多く、配列にかかわらずdATP+精製PCR産物+Taq+PCR bufferで72C反応を行い直ちにTAライゲーションに進んでますが、今まで問題ありませんでした。定量的でない実験なので、この方法が万全かどうかは不明で、できれば5'末端配列にも気を使ったほうがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.442-9 - 2011/05/27 (金) 10:25:10 - ~ 各ステップの操作に問題が無いことを確認した情報というのが少ないので、 どこからやり直した方がいいかを聞かれても、やり直しがいいのか、やり方自体を変えなければならないのかはコメントのしようが無いと思いますが。 増えているのが目的のバンドだと確認できていれば、PCRの条件検討までは戻らなくてもいいと思いますけどね。 (切り出した後で制限酵素処理するなどで、目星はつきますよね) >もう一度ゲル抽出してみるしか手はないのでしょうか？ ngオーダーで量があって、UVに全く当たっておらず、末端にAが付いている断片であれば、私ならばライゲーションからやり直してみます。 また、指摘に触れていませんが、terminal transferase activityのあるDNA polymeraseを使っているのですよね。 活性のない酵素を使っているのであれば、酵素を変えるか、後付でAを付けないと進まないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.442-8 - 2011/05/26 (木) 17:04:19 - AP 目的断片のPCRがスカッときまっていないようなので、最初からけちがついているわけですね。それでも結果オーライならいいですが、そうではないわけで。 だったら、副産物がどの程度生じているのかわかりませんが、まずはPCRをきれいに増やす努力をしてみては。反応条件を振るより、プライマーを設計しなおしたり、あるいはnested PCRがはやいかも。 それと、あんまり変なクローンがいろいろ混じってくるってのは、コンタミかも。泳動槽・バッファなんか

(無題) 削除/引用 No.442-7 - 2011/05/26 (木) 17:02:29 - おお ちょっとサイズがおおきいので、慎重にしたほうがいいですね。UVダメージもとれない一つの要因かもしれません。長波長でもあまりよくないようです。銀紙で出来るだけUVが当たるのをさけるなどしてバンドの端の一部だけで位置を確認しながら切り出した方がいいかもしれません。最近はUVダメージを修復する試薬も売ってあるようですが(詳しいことは知りませんのでどれくらい実用的かわかりません)。 確かにサイズがおおきいのでロングPCR用のPFUけいの酵素をつかっている可能せいはあるので、そうであればAはつかないですね。。。TAQでつけ直さないといけないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.442-6 - 2011/05/26 (木) 15:09:04 - fire ミニプレップをして、制限酵素処理をしてみたんですが、 目的のインサートは入っていませんでした。 シークエンスは外注しており、 少ないサンプルではなかなか出せません（予算の都合上）。 もう一度ゲル抽出してみるしか手はないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.442-5 - 2011/05/25 (水) 19:30:55 - AA 私個人としてはコロニーPCR自体をあまり信用してませんので、 みなさんが既に指摘されているようにコロニーを10個ほど拾い ミニプレップして切りだして確認するのが良いと思います。 個人的な経験ですが、 学部生がコロニーPCRで目的のバンドが出ず困っていたときに、 試しにミニプレップして切り出させてみたら正しいサイズのインサートがあり、 シークエンスに掛けても正しい配列だったこともあります。

(無題) 削除/引用 No.442-4 - 2011/05/25 (水) 18:33:24 - とおり係 Aがつかない酵素を使っていたりして。

(無題) 削除/引用 No.442-3 - 2011/05/25 (水) 17:14:28 - ~ 何で切り出したフラグメントのTAクローニングで、96サンプルもコロニーPCRをしたのでしょうか？ 何か当たりを取りにくいことが予想される背景があるのでしょうか。 また、PCRの条件は妥当と考えられるのでしょうか？ ゲノミックPCR(またはRT-PCR?)よりも甘い条件になっていませんか？ インサート内にプライマーとアニールしうる部分があり、そこから増えた産物が短くて増幅効率が高いために優先的に増えた。 なども考えられると思います。ゲノミックPCRなどと違って持ち込まれるコピー数が多いでしょうから、非特異反応は起きやすいでしょう。 私ならばコロニーPCRと同時に４〜６サンプルくらい増やしてミニプレップし、制限酵素で切り出してインサートサイズを確認します。 そこでもサイズがまちまちであれば、可能であれば複数読んで何が起きているのかを確認します。 見たことのない配列なのか、目的の配列の一部なのかで、対応は変わってくるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.442-2 - 2011/05/25 (水) 16:43:44 - 774 コロニーダイレクトPCRが正確とは限らないので、 制限酵素処理してインサートの大きさを確認してみてはいかがでしょうか？ もし僕が同じ立場なら、（全部やると大変なので）いくつかのサンプルで試してみてシークエンスするんじゃないかと思います。

ゲル抽出後のTAクローニング 削除/引用 No.442-1 - 2011/05/25 (水) 16:31:50 - fire PCRで２つの遺伝子の目的産物(4.5kbと2.9kb)を増幅させまたところ、非特異的増幅断片を確認したので、ゲル抽出を行いTAクローニングしました。その後大腸菌に形質転換し、白コロニーをコロニーPCRにかけました。 96コロニー全てにおいて目的サイズの増幅は確認できず、500bpや100bpさらに2kbの増幅といった各コロニーにおいてバラバラでした。 一体何が原因で目的のサイズがクローニングされないと考えられますか？

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