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(無題) 削除/引用 No.441-5 - 2011/05/26 (木) 10:34:31 - bm 皆様、お返事、誠に有難うございます。 大変参考になりました。 それを踏まえて、再度実験を行ってみます。 あと別の話になりますがひとつ気になったのが、今回のサンプルは、蛋白抽出の際に、大腸組織を数日間-80度で凍結させたものを使用しました。また、lysis bufferでホモジナイズした後、SDSで熱変性させる前にも一度、凍結させています。合計2度凍結させていますが、これが影響している可能性もあるでしょうか？次回は、凍結させていない組織を使用する予定ですが・・ また、マウスから組織を摘出した後、蛋白抽出を開始するまで、他の実験を先に行うために数時間以上〜半日程度の間がある時、保存方法としては凍結させず、4℃くらいが良いのでしょうか？ すみませんが、また教えて下さい。

(無題) 削除/引用 No.441-4 - 2011/05/25 (水) 20:33:51 - ABZO 抗体は劣化してくるとnon-specific なシグナルとか、バックがあがってきたりとかするときあるよ。あと見たいやつがみえなくて、見たくないものが見えてしまうときは分解とかaggregation(SDSサンプル凍結融解繰り返したり古くなったりして還元剤が弱まってシステインの再酸化とかはありうるよ。）も可能性あるかも。 あと当たり前だけど試料（細胞とか組織とか）が前の人と違うなら、前の人が問題なくできたからといっても、あなたの試料でうまく使えるという保証はないよね。

(無題) 削除/引用 No.441-3 - 2011/05/25 (水) 14:27:24 - おお まずはワークしてたという実績があるわけだから、過去の実験などの比較から改善していくのが筋ではないですか? 抗体はロットを含め全く同じですか?過去でワークした時と全く同じサンプルあるいは同等のサンプルでも非特異が出ますか? たしかに非特異をけすということであれこれとやれることは提案されるでしょうがあまりにもその幅が広すぎてどれからやっていいかなんてなる可能性もありますよ。

(無題) 削除/引用 No.441-2 - 2011/05/25 (水) 12:12:45 - ~ 非特異バンドが出るのと、目的のバンドが出ないのは別の問題だと思います。 非特異バンドが出ることについては、そもそも、 >前に行った研究者がワークしていた というのは、その抗体・サンプルの組合せで、目的のバンド以外に非特異がまったくで無いというデータがあるという意味なのでしょうか？ それが書かれていませんので、非特異バンドが出ても妥当な結果なのかもしれません。 また、目的のバンドが出ないことについては、何かポジコンは用意できないのでしょうか？ 抗体が死んでいるのか、サンプルがおかしいのか、それとも操作がおかしいのかは、コントロールを置かないと確認できないかと思います。 最低でも、 >前に行った研究者 の使ったサンプルで再現性を見てみてはいかがでしょうか。 >逆に非特異的なバンドが出る可能性はあるのでしょうか？ 無いと思います。 合ったとしても、前にうまく行っていたやり方でもダメなのですよね？ >蛋白自体が変性している可能性が高いでしょうか？ ウエスタンはSDS-PAGEの後にやっているのではないでしょうか。そうであれば、サンプルのたんぱく質は変性させていますよね。 分解のことを言っているのであれば、サンプルとその調製法次第だと思います。 >以前にワークしているプロトコール通り行ったはずなのですが、何か失敗しやすいところなど そのプロトコルは誰が見ても同じ操作が出来るように書かれているのですか？ それとも具体的な操作内容が書かれておらず、各自で解釈する余地が残っている部分がありますか？ 具体的でない部分（例えばセルペレットをほぐすなど）が、貴方と前任者が違う操作をしている可能性が残されている部分だと思います。

western blottingのブロッキング 削除/引用 No.441-1 - 2011/05/25 (水) 09:04:58 - bm Western blottingをやっているのですが、非特異的なバンドがどうしても消えません。また、目的のバンドも検出できません。 これまで行ったのは、�@ブロッキング剤の検討、�A抗体の濃度を希釈、�B流す蛋白量を減らす、です。 �@ではGE healthcareのブロッキング剤を用い、推奨されている濃度で、室温1時間 or　4度 over nightを行いました。実際はそれよりも少し長く行いましたが、ブロッキングのしすぎで、逆に非特異的なバンドが出る可能性はあるのでしょうか？ また�Aに関しては、data sheetの最低値まで減らしても、消えませんでした。�Bでも、やはり同様です。 蛋白自体が変性している可能性が高いでしょうか？ 1次抗体と2次抗体に関しては、前に行った研究者がワークしていたので、問題ないはずです。 また蛋白抽出に関しても、以前にワークしているプロトコール通り行ったはずなのですが、何か失敗しやすいところなど、アドバイスがあればお願いします。

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