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(無題) 削除/引用 No.438-15 - 2011/06/03 (金) 03:30:12 - おお >[Re:14] うーんさんは書きました : > すいません、追加でお伺いしたいことがあります。 > 2で抽出したRNAの260/280はDNase処理無しでも2.0くらいなのですが、マイクロアレイに使用するときはやはりDNase処理はしたほうが良いのでしょうか？ > 260/280が2.0でRINが10なら、処理は不要でしょうか？ RINはRNAがどれほどインタクトかをみる指標なのではなのでDNAのコンタミを見ているわけではないと思います。ただし山ほどDNAがあった場合は影響するでしょうけど、通常のこれらの方法はDNAが大部分除けるようになっています(それでもPCRでは問題になりますが)。おそらくDNase処理はしなくて良いと思いますが、いちどアフィメト(ですよね)に聞いてみた方がいいかもしれません。 >[Re:13] うーんさんは書きました : > おお様、ema様 > > この結果に関してもコメントいただけますと幸いです。また、２で抽出したRNAを逆転写してPCRで評価まではしていないのですが、念のためGAPDHくらいは増幅してたほうがよろしいでしょうか？ > なんとも言えませんがおそらくそこまでしなくて良いと思うのですが、、、経験のある形のコメントの方が有用でしょうしそういう人のコメントがつけばいいですね。

(無題) 削除/引用 No.438-14 - 2011/06/03 (金) 03:20:47 - うーん すいません、追加でお伺いしたいことがあります。 2で抽出したRNAの260/280はDNase処理無しでも2.0くらいなのですが、マイクロアレイに使用するときはやはりDNase処理はしたほうが良いのでしょうか？ 260/280が2.0でRINが10なら、処理は不要でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.438-13 - 2011/06/03 (金) 02:33:08 - うーん おお様、ema様 ありがとうございます。 少しRNA抽出方法を自分なりに検証してみました。 サンプルは、マウスの小腸を使用して解剖１０分以内にRNAlaterに浸けました。 一晩４度でインキュベートした後、 １．通常のTrizol抽出後、RNeasy精製（Trizol後のイソプロ沈含む） ２．Hybrid法（Trizol＋クロロホルムの水層に直接エタノールを入れてRNeasyカラムに添加する） ３．Hybrid法（ただしポリトロンではなくビードビーターで破砕） 以上の３つの方法で４サンプルずつ抽出してみました。 いずれもDNase処理はしませんでした（結構高いので・・・） 結果、全ての方法で十分量のRNAが取れましたが、 １で抽出したRNAはRINが8.5以上で中には１０もあり（260/280の値が１．８前後なのでDNAがコンタミしている？＝RINに影響？） ２で抽出したRNAのRINは４つとも１０ ３で抽出したRNAはRINが最高のものでも８．４（なかには、２８Sがかなり分解されていて測定不能なものもあり） という様になりました。 １−３の方法で使用する腸管の部位は適度にちらしてありますので、部位の問題はあまり無いと思います。また、かなり水層を残しましたので、中間層は吸っていないと思います。 おお様のご指摘のとおり、イソプロ沈のステップがどうも良くないということがわかりましたので、次からはHybrid法にしていこうと思います。 しかしなぜビードビーターがこんなに駄目なのかわかりません。適切なビーズがなかったので、細菌のゲノム抽出用にキットに添付されているものを使ったのが良くなかったのでしょうか（中、少、極小のビーズが混ざってチューブに入っています）？熱を持たないように、時折冷やしながら破砕したのですが・・・ この結果に関してもコメントいただけますと幸いです。また、２で抽出したRNAを逆転写してPCRで評価まではしていないのですが、念のためGAPDHくらいは増幅してたほうがよろしいでしょうか？

ですね 削除/引用 No.438-12 - 2011/06/01 (水) 19:04:34 - ema >DNaseの影響がでる、というのは具体的にはどのような影響でしょうか？RNAが分解されてしまったりする えーと、某LMD講習会での（裏）データでと↑という結果がでてました。バッファーに特徴があって”しやすい”との説明でした。メーカーにわるいのでここまでで。 RNAseはしっかりフェノール系の試薬で酵素類が焼き切れていれば（検体が大きいと焼き切れてなくて酵素が働きます）問題ないはずです。 感想ですが、DNAが中間層にあるのでたくさんあるとヒストグラムのバックグランドのぎざぎざが大きくなり品質の数字が悪くなる、Agilent2100もゲル充填での電気泳動なので夾雑物の多いサンプルの時に全体的に何かの物質（不明）がかぶりうねったような線の泳動結果がでたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.438-11 - 2011/06/01 (水) 07:06:42 - おお >[Re:10] うーんさんは書きました : > おお様 > ありがとうございます。 > 中間層ってそんなに悪いものなんですね。ここにRNaseが含まれていて、水などにRNAを懸濁したときに分解してしまうということなんでしょうか？ 中間層はタンパクが変性した状態のもであると考えられていますたしかにそのほかの成分もあると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.438-10 - 2011/06/01 (水) 02:01:37 - うーん おお様 ありがとうございます。 中間層ってそんなに悪いものなんですね。ここにRNaseが含まれていて、水などにRNAを懸濁したときに分解してしまうということなんでしょうか？ ググッてみたらTrizolとRNeasyのハイブリット法というのが見つかりました。本日その方法で、試しに抽出してみました。RINの解析はまだですが、とりあえずRNAはとれたようです。また、結果がでたら報告させていただきます。 SDSの濃度、ありがとうございました。自分でググッてみるべきでした。すいません。 ema様 ありがとうございます。やはり中間層ですか。あまり気を使って取っていなかったので、今回からはかなり水層を残してとるようにいたします。DNaseの影響がでる、というのは具体的にはどのような影響でしょうか？RNAが分解されてしまったりするということでしょうか？教えていただけると嬉しいです。

腸 削除/引用 No.438-9 - 2011/05/30 (月) 20:24:02 - ema 体全体の組織のRNAを取って比較する実験をした事があります。 組織的に小腸で、炎症を起こすとか潰瘍がある（そこの部分が壊死してグレードの低いRNAになる）こともあるので、サンプルによって品質はばらつきました。（他の組織も色々ありますが） 手技的に見てRNAlaterにいれ（この時に厚みを薄く、とはいえ粘膜のはぎ取りみたいだから大丈夫でしょう）Trizolに破砕して溶けてしまった時点でそんなに品質が悪くなるステップはないと思います。 品質が悪い→沈殿が溶けにくいは夾雑物が混ざっているかと。 とはいえ混ざっているのが脂質だったりすると取りようも無いので（上清を気をつけて、、、っていても入ります） 元組織が100mgって結構多めにとれてるので大丈夫だと思いますがDNase；Qiaは微量な時には影響があることがあります。

(無題) 削除/引用 No.438-8 - 2011/05/29 (日) 08:34:42 - おお >[Re:7] うーんさんは書きました : > > ＞TROZOLで精製した(いそプロで沈澱させた)RNAはTRZOLをうまく使いこなせてなければ、水に溶かした時壊れてしまいます。 > この点をもう少し詳しく教えていただけないでしょうか？ TRIZOLの量に対してサンプルが多すぎる。中間層のものをとってしまう(場合によっては半分を回収しても中間層から舞い上がったものを取ってしまっているかもしれません。 得られた水そうをクロロフォルムしょりして中間層がなくなるか少なくなるまで繰り返すか、水そうに20%ぐらいのVOLのTRIZOLを加えもうクロロフォルムを加え精製を繰り返すとか。 > ＞RTとか酵素反応はTRIZOLのあとしないのであれば、SDSを含む水で溶かしても良いかと思います。 > これは、RNeasyでの精製に進むのであれば、と解釈してよろしいでしょうか？ そうです。 今思い出しましたが、昔アじレントのアレイようのプロトコールでTRIZOL水そうを直接カラムにのせる方法を推奨していました。水そうを得たあと通常の量より少なめのいそプロパノールを加えて直接カラムに乗せるという方法です。沈殿、とリカバリーをバイパスできるので、分解の危険も場合によっては回避できるでしょうし、ステップも減ります。 > SDSはどの程度の濃度が適切でしょうか？ 1%ぐらいまではいいと思います。 > ポリトロンの件、ありがとうございます。この洗浄に使用するSDSもRNAを懸濁するときと同じ濃度でしょうか？ このばあいSDSもオマジナイのようなものですきれいに洗浄されていた方がいいというわけですけど、しなくてもいいくらいなんですが、、、ググると0.5-1%で使ってるのが多いですね。

ありがとうございます 削除/引用 No.438-7 - 2011/05/25 (水) 16:05:35 - うーん 皆様、ありがとうございます。 TK-1様 細胞や組織量は少し気になっていました。RNAlaterで脱水されているものなので、脱水重量で100mg/mLでは重すぎるんでしょうか？ 310様 組織は全てスライドグラスでスクレイプした腸管の粘膜です。リボソーマルRNAのピークは全てきちんとみえていますが、RINが低いサンプルだとそれ以外の核酸（分解産物？）がみられます。ただ、腸管サンプルなので、バクテリアの16SとかはRINに影響がないのかと少し考えております。 RNAlaterに漬けるサンプル量は適切に調節しているつもりで、サンプルが全てしっかりとRNAlaterに沈み込むサイズにするように心がけております。粘膜なので組織自体が薄いので浸透速度に大きな差はないのではないかと思っているのですが。。。げっ歯類ではなく大動物のサンプルなので採り直しがしづらいなので、なんとか今のサンプルでと考えております。 さく様 上述のとおり、使用しているサンプルは同じ組織なので、RNAlaterの浸透速度は大きな問題ではないのではないかと思いたいのですが。。。肺はRNAが取りづらいのですね、勉強になりました。 おお様 RNAlaterに漬けるステップは上述のとおりで、刻むまではしておりませんが、もともと薄い組織をしっかりとRNAlaterに漬かるように採取しておりますので、大丈夫だと思いたいです。 ＞TROZOLで精製した(いそプロで沈澱させた)RNAはTRZOLをうまく使いこなせてなければ、水に溶かした時壊れてしまいます。 この点をもう少し詳しく教えていただけないでしょうか？うまく使いこなすためにはどういった点に注意すればよいのでしょうか？ご指摘のとおり、TORIZOLが終わった時点で分解されているのではないかと疑っています。RINが低いサンプルは最後にRNaseフリー水に溶かすときに、溶けにくいきがしているためです。 ＞RTとか酵素反応はTRIZOLのあとしないのであれば、SDSを含む水で溶かしても良いかと思います。 これは、RNeasyでの精製に進むのであれば、と解釈してよろしいでしょうか？ SDSはどの程度の濃度が適切でしょうか？ ポリトロンの件、ありがとうございます。この洗浄に使用するSDSもRNAを懸濁するときと同じ濃度でしょうか？ よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.438-6 - 2011/05/25 (水) 14:15:35 - おお > > RNalaterのところ私も気になります。はいつけて安心という風に単純なのもかどうかちょっと疑っています。取った時にの組織のじょうたい、つけるまでの時間、組織は細かく刻んだ方がいいとききますが、若干大きめのものとかがうまくブロックがかかってないとか。 実験によってはできるなら最初からTRIZOLの方がよかったのではというきがします。 TROZOLで精製した(いそプロで沈澱させた)RNAはTRZOLをうまく使いこなせてなければ、水に溶かした時壊れてしまいます。 フォルムアミドかそれを含む水を使うと比較的安全だというはなしを聞いたことがあります。またトライゾールで精製後バイオアナライザーでチェックしてみてもいいかもしれません(どのステップが怪しいのかみるために。たいていこの時点でダメになっていることがたいていだと思いますが)。 RTとか酵素反応はTRIZOLのあとしないのであれば、SDSを含む水で溶かしても良いかと思います。 > ポリトロンは、サンプル毎にDEPC水で洗浄、７０％エタノールで洗浄、RNあZあpでクリーニング、DEPC水で洗浄という操作を行なっております。 TRIZOLでポリトロンをつかうだんかいでそこまでしんちょうにしなくていいですTRIZOLがRNaseをぶろっく してくれますから。SDSでせんじょう 、みずか あるこーるですすぎをするくらいでいいとおもいます(へんかんできなくてよみずらくてすいません)

(無題) 削除/引用 No.438-5 - 2011/05/25 (水) 11:13:34 - さく 以前マウスの色々な臓器からRNAを取ったことがありますが、肺だけやたら苦労しました。フレッシュな肺からすぐに抽出しても、量は取れないしRINも全然ダメで、臓器によってRNA量や分解速度が違うんだろうなぁと思っていました。

(無題) 削除/引用 No.438-4 - 2011/05/25 (水) 06:59:12 - 310 Agilentで解析するRNAの量がばらつき、適切な量からずれているようだとRINの値がおかしくなることがありました。見た目のピークと値が異なることもあります。RINが低いサンプルでもリボゾーマルRNAのピークはきれいに見えていますか？ Trizolのステップで手技で出そうな問題をあえて挙げれば、Trizolの上清をとるときでしょうか？DNAは界面に出るので普通は抽出されませんが、いつもぎりぎりまでとるせいかRTなしのPCRで増えてしまうことがありました。 RNA-laterは組織により浸透速度が異なります（浸透というより脱水ですが）。組織を切るサイズを小さくするのも一考かと。 それでも駄目なら、採れたて組織でRNA抽出を途中まで行い、最後のエタ沈で止めておいて、使用直前に乾燥、溶解を行うと言う方法もあります。1回あたりの処理サンプル数が少ないと、試薬を加えるタイミングがより均一になるので、ばらつきは減るのではと思っています。

(無題) 削除/引用 No.438-3 - 2011/05/25 (水) 02:28:50 - TK-1 > 全てのサンプルのRINが低いなら手技の問題かとも思うのですが、 すべてが悪ければ、試薬の問題で、サンプル間でばらつくのは手技の問題かと思いますが。 > このRINのばらつきは何が原因だと考えられますでしょうか？ サンプルの採取からRNalaterに漬けるところまでは単純な作業ですし、RNalaterに漬けるまでの時間にサンプルごとで大きな差はありません。抽出処理も全て同様に行なっているつもりですが、抽出の過程でRINを低下させる、つまりRNA integrityを低下させ得るようなステップがあるのでしょうか？それだと全てのRINが低下するような気もするのですが・・・・。確証はないのですが、RINが低いサンプルは、Trizolの最後にRNase　Free水に懸濁するときに溶けにくいきがしていますが、関係ありますでしょうか？ ゴミが残っている？トライゾールに溶かすときに、細胞や組織の量が過剰？

(無題) 削除/引用 No.438-2 - 2011/05/25 (水) 02:26:00 - TK-1 >[Re:1] うーんさんは書きました : > RNAのintegrityについて教えてください。 > 現在、AffymetrixのGenechipで解析するためのRNAを動物の組織から抽出しています。 > > 組織は、RNalater内で冷凍保存されていたもので、 > １．ポリトロンホモジナイザーで使ってTrizol内でサンプルを破砕 > ２．イソプロ沈、７５％エタノール洗浄までのステップを説明書に従い実施 > ３．RNeasy mini kitを使って精製（DNase処理を含む） > という方法で抽出を行っており、ほとんど説明書に従っています。 > ポリトロンは、サンプル毎にDEPC水で洗浄、７０％エタノールで洗浄、RNaZapでクリーニング、DEPC水で洗浄という操作を行なっております。当然ですが、滅菌済みの機具を使用しておりますし、手袋などもきちんとしております。 > > 抽出したRNAの濃度や260/280、260/230は問題ないのですが、アジレントのバイオアナライザーでRINを算出したところ、サンプルごとでRINがずいぶんと異なっておりました。よいものだと９を超えるのですが、悪いものだと７以下のものもあります。全てのサンプルのRINが低いなら手技の問題かとも思うのですが、このRINのばらつきは何が原因だと考えられますでしょうか？ > サンプルの採取からRNalaterに漬けるところまでは単純な作業ですし、RNalaterに漬けるまでの時間にサンプルごとで大きな差はありません。抽出処理も全て同様に行なっているつもりですが、抽出の過程でRINを低下させる、つまりRNA integrityを低下させ得るようなステップがあるのでしょうか？それだと全てのRINが低下するような気もするのですが・・・・。確証はないのですが、RINが低いサンプルは、Trizolの最後にRNase　Free水に懸濁するときに溶けにくいきがしていますが、関係ありますでしょうか？ > なかなか良いRNAが取れずに困っております。どうぞ、ご意見、ご助言お願いします。 > > >

RNAのintegrity 削除/引用 No.438-1 - 2011/05/25 (水) 00:04:50 - うーん RNAのintegrityについて教えてください。 現在、AffymetrixのGenechipで解析するためのRNAを動物の組織から抽出しています。 組織は、RNalater内で冷凍保存されていたもので、 １．ポリトロンホモジナイザーで使ってTrizol内でサンプルを破砕 ２．イソプロ沈、７５％エタノール洗浄までのステップを説明書に従い実施 ３．RNeasy mini kitを使って精製（DNase処理を含む） という方法で抽出を行っており、ほとんど説明書に従っています。 ポリトロンは、サンプル毎にDEPC水で洗浄、７０％エタノールで洗浄、RNaZapでクリーニング、DEPC水で洗浄という操作を行なっております。当然ですが、滅菌済みの機具を使用しておりますし、手袋などもきちんとしております。 抽出したRNAの濃度や260/280、260/230は問題ないのですが、アジレントのバイオアナライザーでRINを算出したところ、サンプルごとでRINがずいぶんと異なっておりました。よいものだと９を超えるのですが、悪いものだと７以下のものもあります。全てのサンプルのRINが低いなら手技の問題かとも思うのですが、このRINのばらつきは何が原因だと考えられますでしょうか？ サンプルの採取からRNalaterに漬けるところまでは単純な作業ですし、RNalaterに漬けるまでの時間にサンプルごとで大きな差はありません。抽出処理も全て同様に行なっているつもりですが、抽出の過程でRINを低下させる、つまりRNA integrityを低下させ得るようなステップがあるのでしょうか？それだと全てのRINが低下するような気もするのですが・・・・。確証はないのですが、RINが低いサンプルは、Trizolの最後にRNase　Free水に懸濁するときに溶けにくいきがしていますが、関係ありますでしょうか？ なかなか良いRNAが取れずに困っております。どうぞ、ご意見、ご助言お願いします。

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