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(無題) 削除/引用 No.430-9 - 2011/05/25 (水) 20:23:07 - ABZO ボロン酸さっき調べたらほんとの名前はフェニルボロン酸樹脂(担体）というやつらしい。ただこれ、glycated　proteinだけでなくて糖タンパク質（糖鎖）もくっつくみたいだ。だから、あんまりよくないかも。普通存在量的にはglycated protein<<< 糖タンパク質とおもうのであまり得策でないかもしれない。いろいろ試してどうしても埒あかないというときは最後は力技で2D-PAGEの繰り返しかな。糖化が起こるのは主にリジン残基だとおもうので、チャージが変わってもしかするとスポットが酸性側に少しずれる可能性ある。本来の未修飾の蛋白質と位置がズレるので、うまくすると修飾体のみ分離できるかもしれないし、あるいは逆に量が少なくてクマシーで染まらないかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.430-8 - 2011/05/25 (水) 13:54:27 - おお よくよく見ると意図を汲み取れないところがあります。 まず修飾されたタンパクの同定なら比較的早いと思います。IPでなるべくノンスペなど拾わない、一度変せいさせるなどしてノンこばレンとな結合をしているものを排除してからIPなどの方法がとれます。とりぷしんで切ってからIPでもいいでしょうね(どなたかの指摘にあるように)。 とうさ修飾自身が未知のものであるなら、マスを測定しながら構造を探っていく必要があるので根気がいると書きました。ヘテロであればもっと大変になるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.430-7 - 2011/05/25 (水) 09:37:03 - ~ 「データベースにない」という部分を「未知の」という意味で読んでいましたが、そのデータベースにないだけで分析されたことがある糖鎖が対象であれば、 https://ruo.mbl.co.jp/jutaku/sugar_chain_structure.html?gclid=CPbt9uTqgakCFYlypAodb0ALSw のような外注の方がいいのかもしれません。 予想している糖鎖修飾は、上記のHPに書かれている約600種類の糖鎖に含まれていると予想しているのでしょうか？ おそらくは、問い合わせれば、どのような糖鎖が分析可能なのかは提示されると思います。 サンプルの調整方法やMSの立ち上げにかける時間と人件費をカウントするのであれば、まずは外注で様子を見てみたほうが、安上がりだと思います。

ありがとうございました。 削除/引用 No.430-6 - 2011/05/25 (水) 09:08:40 - K MSの操作など経験がないので、外注しようかと考えていたのですが、やはりかなり複雑なようですね。覚悟して取り掛かります。 ボロン酸カラムについても、調べてみます。RAGEアフィニティカラムというのも、時間を掛けてでもやる価値があるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.430-5 - 2011/05/24 (火) 23:40:26 - ABZO あんまよく知らないけど学校で習ったのは、たしかボロン酸カラムかなんかで捕まえる事ができるということだったとおもう。一応生化学の教科書確認してください。もちろんアフィニティ一発できれいになるという事じゃないと思うんで、現実にはにはpurifyというよりenrichmentという感じとおもうけど。AGEまでいったやつとかその手前のやつとかなんか構造的にいろんなのあるし糖化といってもものすごいヘテロだから難しいそうだね。2-Dとか、使える抗体によるIPも組み合わせるとかすればある程度量の多いものならば成功するかもね。でもなにせエピトープがちっちゃいし周辺アミノ酸の配列とかも響きそうだしね。やっぱ簡単じゃないかもね。糖化蛋白質の構造解析とかってあんまりみないしね。RAGEとか固相化したアフィニティーカラムつくってためしてみたらどうかな？ 糖化蛋白質をgetできさえすれば、LC−MS／MSとかあれば、同定は精製とくらべれば全然難関じゃないとおもう。ただ修飾部位はうまく見つけられるかどうかは運かもしれない。 あとね、これはほかの修飾の研究での話だけどね、あらかじめ蛋白質混合物をトリプシンで分解してバラバラにしてペプチドにしてからアフィニティー精製にかけて、得られたペプチド（理論的には糖化部位を含むペプチドがいっぱい濃縮されているはず。）をMSにもってくという作戦も時々使われるよ。これなら同定はもちろん修飾部位も見つけられるチャンスが増えるかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.430-4 - 2011/05/24 (火) 16:17:23 - ~ >どのような手法が適切か、教えて下さい。 機器の制限は無いと考えていいのでしょうか。 また、その糖化はたんぱく質全体にわたって行われていると仮定しているのでしょうか。 MS/MSで糖化していないペプチド断片数箇所を読んで、ゲノム情報（たんぱく質データベース）と照会できれば、同定自体は可能なのではないでしょうか。 MSがなくても、エドマン分解でもいけるかもしれません。 >データベースにないようなマイナーな修飾だった場合、同定は可能なのでしょうか？ 登録されていない修飾を同定するのであれば、貴方がその糖鎖の分析系を立ち上げることになるでしょう。 それが可能かどうかは、貴方がどこまでやるか次第でしょう。 MSに加えて、LC、酵素切断、化学分解、修飾あたりも使えば、不可能では無いと思います。

(無題) 削除/引用 No.430-2 - 2011/05/24 (火) 13:54:31 - おお MSでやれば、理屈では何とかなるかもしれませんが根気が入る可能性があるのではと、、、

糖化された未知のタンパクの同定 削除/引用 No.430-1 - 2011/05/24 (火) 11:52:31 - K タンパクの糖化(non-enzymatic glycosylation)に興味があります。 ウェスタンで、糖化を認識する抗体で光ってくる未知のバンドを同定しようとするとき、どのような手法が適切か、教えて下さい。 免疫沈降で糖化されたタンパクをpull downするとして、データベースにないようなマイナーな修飾だった場合、同定は可能なのでしょうか？

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