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(無題) 削除/引用 No.425-9 - 2011/05/26 (木) 01:16:34 - Kanata 途中で切れてしまったので追記します。 APさん 免疫沈降の場合もそういえます。 私が以前加わったプロジェクトで扱った事例ですが、IPしたのちの1バンドから複数の蛋白質が同定されました。WBでも確認できたそうです。まだ投稿されていないようなので詳細は書けませんが。SDS-PAGEの分離能がどれほどよいかということ、さらにSDS-PAGEの分離は単に分子量だけではなくmobilityによるものもあることから、1バンド＝1蛋白質とは言い切れないという認識です。 　既存のIP-> SDS-PAGE --> MALDI-TOFのアプローチでも確かに結合蛋白質を同定することは可能ですが、当時の技術では1蛋白質の同定が限界だったのではないかと思います。 　最近の手法、技術の向上によってさらなる知見（アバンダンな蛋白質以外もつかまえられる）を得ることが可能になりました。恐らくまだ分析屋の手元で活用されている段階で、生物系研究者の方々には情報が届いていないのかもしれません。 このトピックでのコメントを拝見して、もっと質量分析法によるアプローチについて情報をupdateしないと、と感じました。

(無題) 削除/引用 No.425-8 - 2011/05/26 (木) 01:12:26 - Kanata ~さん、 サンプルにもよりますが、2D-PAGEした場合1スポットに含まれるたんぱく質の数は3〜6個に及ぶ、という論文を見たことがあります。最初見たときは衝撃の論文でした。 1スポット＝1蛋白質という意見はよく聞くのですが、MALDI-TOF/MSによるアプローチとして混合物になればなるほど蛋白質の同定精度が落ちます。（サーチエンジンのアルゴリズムの問題ともいえます）そのため、1つしか同定できないことが多く、実際には複数の蛋白質が含まれている可能性も多々あります。IPG strip の分離能は0.1のpIを分けられるほどではないので、１スポット＝複数蛋白質というのはあることです。実際自分でもLC-MS/MSで経験しました。（もちろん、1スポット＝1蛋白質というケースもありますが）ちなみにスポットが検出できない＝蛋白質が存在しない、ではなく、「検出量にいたるだけの蛋白質が存在しない」だけであって、そこには蛋白質が存在している可能性大です。（これは特にCBBで染めた場合に。） APさん 免疫沈降の場合もそういえます。 私が以前加わったプロジェクトで扱った事例ですが、IPしたのちの1バンドから複数の蛋白質が同定されました。WBでも確認できたそうです。まだ投稿されていないようなので詳細は書けませんが。SDS-PAGEの分離能がどれほどよいかということ、さらにSDS-PAGEの分離は単に分子量だけではなくmobilityによるものもあることから、1バンド＝1蛋白質とは言い切れないという認識です。 　既存のIP-> SDS-PAGE --> MALDI-TOFのアプローチでも確かに結合蛋白質を同定することは可能ですが、当時の技術では1蛋白質の同定が限界だったのでは�

(無題) 削除/引用 No.425-7 - 2011/05/24 (火) 15:51:41 - AP 独り言ですが 個々の事例ごとに問題が生じるかどうか、どの程度まで高精度を求めるかは違うと思いますが、一般論でいうと、 全抽出タンパク質からプロテオームをやろうとかいうのとちがって、免疫共沈物に含まれるタンパク質の種類は限られていて、複雑性がはるかに低いので、一次元のSDS-PAGEの分離でやることが多いようです。それで、十分である場合が多いし、文献上も多くの例がみられます。もし、それで不十分、問題があるという事例なら、それ以上の工夫が加えられるでしょうが。 >検出できていないだけで、実際は複数の蛋白質が含まれることのほうが多いのです。 これは免疫沈降物を相手にする場合でも一般的にいえるの事なのですか？ そうだとしても、その意味は何を求める実験かによるんじゃないでしょうか。 たとえば、あるタンパク質にアソシエートするタンパク質を一つ残らず網羅的に取り尽くそうというのか（しかし、どんな方法にせよ「取りこぼしがない」ことを証明するのは困難でしょうが）、何か一つでもそういうタンパク質を見つけて、キャラクタライズしようというのか、とか

(無題) 削除/引用 No.425-6 - 2011/05/24 (火) 11:20:48 - ~ 2D-PAGE(1D:IEF, 2D:SDS-PAGE)にすれば、1スポットはほぼ1タンパク質になるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.425-5 - 2011/05/24 (火) 05:56:51 - Kanata APさん バンド一つにほぼ1蛋白質というのはあまり同意できません。 検出できていないだけで、実際は複数の蛋白質が含まれることのほうが多いのです。普通にバンドを切り出してMALDi-TOF, TOF/TOFで同定すると頑張っても2つぐらいが限度の同定ですが、SDS-PAGEではなく、LC分離（もしくはトリプシン消化してからLC分離）ののちにMALDI-TOF解析すると、同定される蛋白質の数は格段に上がります。 分離できているか、出来ていないかで同定出来る蛋白質の数が変わってしまうのがMALDI-TOF/MSの欠点です。蛋白質が一つしか同定できなかったというのは「一つしか存在しない」という意味では、実はないのです。 なので、Interactionしている蛋白質を解析するときには他のＭＳを使うことをお奨めしたいところです（可能であれば）。

(無題) 削除/引用 No.425-4 - 2011/05/23 (月) 18:15:17 - AP 教科書的には、免疫共沈などの方法で、プローブとなるタンパク質に結合しているタンパク質を回収します。回収物をまとめてSDS-PAGEにかけて分離して、それぞれのバンド（ほぼ一種類のタンパク質に対応すると考えてよい。複数種類混じっていたとしても、数は知れている）を切り出して、定法に従いそれぞれをTOF-MSにかけて、タンパク質を同定します。

(無題) 削除/引用 No.425-3 - 2011/05/23 (月) 08:49:36 - ~ Coimmunoprecipitationもキーワードに加えて検索すれば、興味がある解析方法に近づくと思います。 （アフィニティーカラムなどで回収しているものもあるのかもしれませんが）

(無題) 削除/引用 No.425-2 - 2011/05/23 (月) 01:06:58 - Kanata TOF-MSを使って、というよりは、タンパク質Ａと結合する蛋白質を釣り上げて、それをTOF-MSで解析したということではないでしょうか？（TOF-MSを使う実験系と言う意味） TOF-MSでなくてもできることに感じられますが。 PubMedで検索してみるといいかもしれませんよ。

TOF-MSについて 削除/引用 No.425-1 - 2011/05/22 (日) 19:11:58 - KAZ 研究を始めた学部学生です。 基本的な質問ですみません。 TOF-MSを使って、ある蛋白質と結合している蛋白質をリストアップできると聞いたことがあるのですが、その原理や詳細について調べてもよくわかりません。 （TOF-MSの原理自体は何となくですがわかったのですが、TOF-MSを利用してどうして蛋白質同士の結合をリストアップできるのか、謎です。） どなたか詳しい方いらっしゃいましたらどうかご教授ください。

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