全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.42-5 - 2011/02/21 (月) 22:42:47 - EGFP-TG_mouse ＞nanaさん ありがとうございます。 現在は、サザンができる設備的な環境下ではないので、 マウスには申し訳ないですが、分離比が有効な手段かと思い、行っています。 しかしながら、 コピー数が2以上ですと、 TG_mouse　x Wildにて生まれてきた仔がすべてgenpypingで陽性であれば、 親のTG_mouseがホモの可能性が高いとも言えなくなりますね。 正確にコピー数を見分ける必要はないのですが (発現抑制のかからないホモ接合体が得られれば良いと言う意味です)、 同腹の仔が不均一にEGFPを発現してしまう場合、 仔をまとめて培養細胞単離等に利用することができなくなります。 (細胞数を稼ぐため個体数が多い方が助かるので) 「genotyping」とは 新生仔の後肢の足指や尾の先端の一部からゲノムを抽出し、 PCRをかけて導入遺伝子が挿入されている個体かどうかの判定を行う方法ですので、 nanaさんのPCRの説明に近いものです。 KOマウスですと、ノックアウトするためのネオマイシン耐性遺伝子などの挿入位置が決まっていますので、 挿入個所の、外側、内側でのプライマーによるPCRでホモとヘテロの判定が確実に可能です。 ＞APさん ありがとうございます。 Wildとかけ合わせた仔の組織でも、EGFPの発現は眩しいくらい、強発現なのが今のところ救われている点です。 (これがタンデムリピートのためで、だんだん抑制がかかると残念ですが) 当面の、このTGマウスの利用目的は、 EGFP発現細胞と未発現細胞をFACSで分離回収し、 いくつかの遺伝子発現の差異を検出したいと考えていますので、 単離前のそれそれの仔の組織のEGFP発現強度を観察して、強いもののみ使用してみます。 EGFP発現細胞と未発現細胞の分離性の保証はそれぞれに特異的なmRNAで裏付けたいと思います。 一方で、このTGマウスは他の研究者も利用予定で、 マウスの継代を継続しなければならないのです。 だんだん、TGでの挿入遺伝子の発現低下が起こることはよく聞きます。 発現抑制した系を除いていく方法はご存知でしょうか？ 発現部位の組織は生きたままでの摘出ができないです。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.42-4 - 2011/02/21 (月) 20:43:22 - AP TGの場合、しばしばタンデムに連続したコンストラクトがゲノムに挿入しています。そういうのは、inverse PCRやサザンでは区別が難しいかもしれません。 もしタンデムリピートになっているとすると、ホモ接合体として継代しても不等交叉でコピー数の増減が起こります。また、このようなリピートはメチル化のターゲットになってエピジェネティックな発現抑制がかかる可能性があります。 ということで、congenic化, isogenic化したつもりでも、発現のばらつきが生じるということが起こる可能性はあると思います。

(無題) 削除/引用 No.42-3 - 2011/02/21 (月) 17:19:56 - nana 細かいことですが 導入遺伝子のコピー数というのは、ホモ接合体かヘテロ接合体かに関わらず、導入遺伝子がひとつの遺伝子座にあるのか、複数の遺伝子座にあるのかをいうのではないのでしょうか。 たとえば ある遺伝子座に一つだけ挿入（仮にTG1）を持つ個体であれば、１コピーとなりますが、その挿入についてホモ接合（TG1/TG1）かヘテロ接合（TG1/+)によって遺伝子量（gene dosage）の違いはあり得ます。 2つの異なる遺伝子座に挿入（仮にTG1とTG2）を持つ個体であれば2コピーとなり、その挿入については、 両方がホモの場合（TG1/TG1, TG2/TG2）や 一方がホモで他方がヘテロの場合（TG1/TG1, TG2/+） 両方ともホモの場合（TG1/+, TG2/+）など 他にもいろいろパターンがあって、表現型の分離比からコピー数を見分けるというのは相当難しいことになると思います。 余計なことかもしれませんが、念のため。

(無題) 削除/引用 No.42-2 - 2011/02/19 (土) 14:31:23 - nana マウスの専門家ではありませんが．．． コピー数については、導入遺伝子をプローブとしたゲノムサザンで見てください。いくつか制限酵素を試して、いずれでもバンド1本ならシングルコピーとみなしてよいと思います。もちろん、子孫の分離比を見てもよいでしょうが、複数コピー存在する優性遺伝子を、F2などの分離比で見るのは面倒なのでは？ 導入遺伝子がホモになっているかどうかの確認はPCRで。挿入個所をインバースPCRで決定して、挿入個所の両側にプライマーを設定した場合と、挿入個所の片側と導入遺伝子の内部にプライマーを設定した場合とを比べれば、その個体が、その導入遺伝子についてホモかヘテロか分かりますよね。 もしかして、マウスってもっとややこしいことが必要なんですか？ ところで「genotyping」って、どうやっているのですか。

トランスジェニックマウスのホモの作製(No.3953より転載) 削除/引用 No.42-1 - 2011/02/18 (金) 21:30:35 - EGFP-TG_mouse トランスジェニックマウスのホモの作製 No.3953より転載 Actiasさん ありがとうございます。 このEGFP-TG_mouseは海外の研究室から譲り受けたもので、 譲り受け後、諸事情により、すぐに精子凍結にて保存されていたものを バックグランド(wild type)のマウスに産ませた状況です。 その仔らのgenotypingはすべて陽性でしたので 保存された精子はすべてEGFP遺伝子は持っていると思います。 しかしながら、 どこまでコンジェニック化、コピー数は不明です。 バックグランドのマウスに産ませた仔同士を掛け合わせ、 その中のどれがホモかを見出すために、 wild typeと掛け合わせて生まれた仔すべてがEGFP発現していれば wild typeと掛け合わせたTGマウスはホモの可能性があるとして判断しようとしています。 この時に、EGFP発現の程度が兄弟姉妹でずいぶん違っていました。 最初は、蛍光顕微鏡の観察で、EGFP発現がないと判断した仔のgenotypingが陽性となったことから、よくよく蛍光顕微鏡で観察すると、組織のほんの一部で発現が見られました。 コピー数が一定でないのかもしれないとも思えますが、 兄弟姉妹間でもそのようなバラツキがありますでしょうか？ よろしくお願いします。 > EGFP導入領域の活性化／不活性化もあるけど。 > > そのマウスは、どこまでコンジェニック化が進んでいるのでしょうか？ > > コピー数は？ > > たとえばコピー数１なら、当然、ホモ個体ではありません。（性染色体を除く）。 > コピー数２なら、ホモか、ヘテロ。ヘテロの場合でも、同じ染色体に2個載っているか、別の染色体に1個ずつ載っているか。別の染色体といった場合でも、2番と2番も有りだし、2番と10番もある。 > >

全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---