全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.419-9 - 2011/05/22 (日) 16:09:24 - U ABZOさん コメント有り難うございます。組織サンプルに制限がなければ、転写因子の検出を目的とするライセートは、SDS sample bufferに直接溶解する形(whole cell lysate)でとるべきと思います。今回は少々事情があり、whole cell lysate以外の方法を検討せざるを得ない状況であるため、ここで皆さんのお知恵をお伺いさせて頂いているわけです。少々非科学的な議論になっている点は大目に見てもらえると幸いです。 ABZOさんのコメントを見て、よりよい方法があることに気付きました。detergentで可溶画分を回収したのち、不溶画分をsample bufferで溶解すれば、細胞質蛋白、可溶画分に存在する目的転写因子、不溶画分に存在する目的転写因子をそれぞれ定量的に評価可能と思われます。この方向で考えてみる事にします。本当にどうも有り難うございました。

(無題) 削除/引用 No.419-8 - 2011/05/22 (日) 13:13:44 - ABZO 濃度や時間にもよるかもしれないけど一般的にはdetergentの中ではTriton X-100は核はあまり壊さないとおもう。古典的な方法だけどきれいな核分画とるときtriton X100使うくらいだから。塩濃度1Mくらいまで上げるとDNA結合蛋白質もけっこう溶け出してくるけどね。 RIPA はデオキシコール酸Naみたく強力なやつも入ってるからそれなりに核も破壊すると思うけど、核蛋白質全般を非特異的に抽出できるかというとわからない。RIPASのSDSは濃度低いしSDSとあまり合わないNP-40とかTritonとかが高濃度で入ってるなかで果たしてどこまで働いているのか疑問。 蛋白質はもうケースバイケースなので、ある転写因子が可溶化できる条件がそのままあなたの蛋白質のも有効とはこればかりはだれも保証できない。時には、いくつか試してかつ必要に応じて自分でも組成を改変して一番良さそうな方法を自分で編み出す必要もあるかもしれない。 あと大事な事はね、細胞内のその転写因子のうちどのくらいが回収されているのかということなんだ。全体の数%程度が回収されたとして,でもウェスタンは高感度なのでちゃんとシグナル見えて、それでOKとしていいかどうかということなんだ。細胞内のdistributionとか修飾状態とかがいろいろだったりしたとき、比較的マイルドな、言い換えれば選択性の高い抽出条件でその一部のものが回収されてしまい、それをその蛋白質の代表的な姿と見てしまうと、誤った結論を導いてしまう恐れがあるとおもう。ある条件で抽出して、それで残った沈殿はSDS sample bufferとかで溶かしてそっちにどのくらいあるのか、またそっちも、当初の条件で抽出した方とおなじ挙動を示すのかそうでないかは必ず確認する必要があると思う。だから細胞／組織自体をSDS　sample bufferで直接可溶化して出来る限り多種多様な蛋白質を非選択的に抽出してみることも平行して行うべきだと思う。

(無題) 削除/引用 No.419-7 - 2011/05/22 (日) 12:49:57 - U おおさん どうも有り難うございます。リンク先は、いずれも核蛋白抽出のプロトコール（低浸透圧バッファーで細胞膜を壊し、核を遠心で集めた上で、高塩濃度のバッファーで溶出する）ですね。組織や細胞を直接、このプロトコールの高塩濃度のバッファーで溶かす事は可能でしょうか?　あるいは、detergentをこのバッファーに混ぜれば、1ステップで細胞膜の破壊と核蛋白の抽出が可能でしょうか? 取り急ぎマウス細胞株を用いた比較実験（Triton-X, RIPA-SDS, RIPA+SDS, sample buffer）で、目的とするリン酸化転写因子と細胞質蛋白質のブロットを見てみます。もし、sample bufferと比べて、他のいずれのバッファーでも、転写因子のリン酸化シグナルの低下をきたすようなら、RIPA+SDSのNaClを0.42Mまで上げてみます。その結果をもとに一回マウス組織でテストしてみます。細胞株とマウス組織では最適条件が異なることも十分予想され、マウス組織でうまくいかない場合は核抽出を試す事になると思います。

(無題) 削除/引用 No.419-6 - 2011/05/22 (日) 09:35:38 - おお detergent≤ RIPA-SDS ≤ RIPA+SDS ≤ sample bufferという感触はありますが、条件が弱くてもほとんど溶出する時は、それ以上条件を強くしても回収率はほとんど変わらないと言って良いのではとおもいます。detergentの種類も関係してくるかもしれません。EDTAやグリセロールの添加などそのほかのパラメーターも微妙に関係してくるかもしれません。 核抽出は目的、スケールによって色々ですが300mM以上ですかね。。。１度スプライシングにかんするタンパクを420mMNaClで抽出して、収量が悪かったので倍ぐらいに上げたことがあります。その他のスプライシングにかんするタンパクで420mMでほぼ十分だったものもありました。活性も考慮に入れてましたのそこそこの回収率があればいいと思ってましたのであまり何%取れたとは言いがたいです。 http://www.koko.gov.my/CocoaBioTech/Protein%20Purification21.html http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/research/Protocols/III.%20Proteins/C.%20DNA-Protein%20Interactions/1.%20Nuclear%20Extracts.pdf

有難うございます 削除/引用 No.419-5 - 2011/05/22 (日) 04:54:53 - U 皆さん、お返事どうも有難うございます。 TK-1さん リン酸化された蛋白質を検出する予定で、蛋白抽出のプロセスは可能な限りシンプルにしたいと考えているため、nuclear extractの抽出は今のところ1st lineでは考えていません。今後の結果によっては検討すべきと思われます。マウスの数が限られており、1st lineの予備実験としてどれから始めるのが得策なのか、という点が問題です。Triton1%で塩濃度を上げる場合、NaClで0.3-0.5Mくらいでしょうか、それとももっと高い濃度が必要でしょうか？ TSさん どうも有難うございます。ソニケーションは一つの選択肢ですね。とりあえず細胞株のライセートで予備実験してみます。 おおさん p53については、私もdetergentのbufferで十分回収できた経験があり、今回Triton-Xで他の転写因子も取れるのではないか、と考えた理由でもあります。ただし、p53の場合、実験条件によっては、detergentで抽出した場合とsample bufferで直接溶解した場合で微妙に異なる結果が得られた経験もあり、detergentではDNAに結合したp53を部分的にロスしている可能性もあるのでは、と少々気になっています。 TK-1さんにもお伺いしていますが、核内蛋白抽出のために塩濃度を上げる場合は、どのくらいを目処にされていますでしょうか？　また、高塩濃度のバッファーで転写因子を溶出した経験がありましたら、教えてもらえませんでしょうか？ SDS抜きRIPAは一つの選択肢として考えていますが、使用した経験が自分自身ないため、ちょっと躊躇しています。おおさんはdetergent, RIPA-SDS, RIPA+SDS, sample bufferで抽出効率を直接比較された経験などありますでしょうか？自分でも細胞株で比較実験をやってみる事にします。

(無題) 削除/引用 No.419-4 - 2011/05/21 (土) 12:14:32 - おお 個々のタンパクで違うと思いますので答えようがないです。RIPA(TXー100/NPー40、1% deoxycholate 0.2%-、0.1%SDS)は大抵のものを溶出するとされています。だた明らかに不溶せいのものが沈殿していますが。 転写因子ではないのですが、CDK、CYCLIN(特にセルサイクル関連)は核タンパクですが1%TRITONXー100だけで溶出することがおおいです。Rb、p53なんかもそうじゃないかと思います。後者は転写関連に明らかに関与していますね。 スペックるにあるスプライシング関連のものは高い塩濃度で溶出する方が1%TRITONXー100よりは効率がいい場合が多いです。 SDS抜きRIPAあるいは、deoxycholate単独でも1%TRITONXー100より全体的には効率がよさそうだと思うことがあります。

(無題) 削除/引用 No.419-3 - 2011/05/21 (土) 12:05:43 - TS Lysisバッファー組成だけでなく、サンプル調製方法にも大きく依存すると思います。 超音波を使う予定だとか、ポリトロンを使う予定だとか、いろいろ。。。

(無題) 削除/引用 No.419-2 - 2011/05/21 (土) 11:46:17 - TK-1 取れるでしょうが、蛋白によって効率は違うでしょう。 nuclear extractをとればtriton単独よりはきれいに取れると思いますけど、それではできないんですか？あとは、Triton 1%くらいで塩濃度を上げてみても、州立はあがると思います。 いずれにせよ、予備実験をしないと何ともいえないと思います。

Triton-Xで転写因子の抽出は可能？ 削除/引用 No.419-1 - 2011/05/21 (土) 03:22:30 - U 細胞外からの刺激により細胞質でリン酸化された後、核内に移行して転写因子として機能する蛋白質を、トランスジェニックマウスの組織からの蛋白抽出液を用いてウエスタンブロットで検出しようと考えています。この抽出液を用いて他の蛋白質（主に細胞質の蛋白質です）の検出も合わせ行う事にしており、それらの検出には、Triton-Xバッファーで十分である事が、これまでの実験で確認されています。（サンプルバッファーで抽出すると、いくつかの蛋白質のウエスタンでシグナルが低下したり、ノンスペが著しく増加したりします。RIPAは試していません。） ここでお伺いしたいのは、活性化して核内にあり、DNAに結合している転写因子をTriton-Xバっファー（あるいは他の界面活性剤やchemicalを含むがSDSを含まないバッファー）で抽出できるかどうか、という点です。RIPAなど低濃度のSDSを含むバッファーを用いるか、あるいは、サンプルバッファーで直接溶解する方法が一般的とは思いますが、マウスの数が限られており、１マウスから得られる組織の量も微量なので、可能ならば、一つの抽出法で全ての蛋白を検出したいと考えています。 特に、DNAに結合している転写因子がTriton-XバッファーやRIPA(0.1%SDS)でどの程度抽出できるのか、教えて頂けると助かります。よろしくお願いします。

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---