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(無題) 削除/引用 No.415-9 - 2011/05/22 (日) 04:42:42 - おお 尿素のかわりに塩酸グアニジンを使うてもあるかとおもいます。この時は徐々に濃度を落としていくより急激に落とす方がいいので希釈を行うことがおおいです。ただ透析もやってみる価値はあるかもしれません(保障の限りではありませんが)。 あとどなたか触れてたと思ったのですが、よく見るとふれていなかったので加えますと塩濃度を高いままで透析する。ナトリウムではなくてカリウムやリチウムをつかうなどもあり得る方法かもしれません。 イオン結合を切ることがありますので溶ける可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.415-8 - 2011/05/22 (日) 04:29:59 - おお ちょっとスッキリしないことがあります。 �@インダクションの温度を25℃（今までは37℃）に下げる→効果あり �AIPTGの量を0.4倍に減らした→効果あり タンパクを１度変性させて、リフォールディンぐをするんですよね。 上記の手法は非変性条件下で可溶画分にくる(構造が正しいとおもえる)タンパクを得るためによくやります。１度変性させるなら直接は関係ないですよね。収量がへったから見かけ上沈殿してくるタンパクがへっているのではないでしょうか。。。 変性させずに可溶性フラクションの収量をあげるという選択肢を取らないのは何故ですか? サルコしルで溶解してTWEENやTRITONを含む溶液に置換したというのを見たことがあります。ただこれはHISカラムは使えないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.415-7 - 2011/05/21 (土) 19:20:38 - qq こればかりは、ケースバイケースなのですが、4M尿素は、完全変性させるにはやや薄いですし、変性前の抽出にしては、濃いように思います。 変性させて精製したタンパクを再生する時は、6M尿素あたりから、4M,3Mと徐々に透析で尿素を除いて、特にタンパクが変性・再生しかける（本当かなあ？）2.5-1.5M辺りの尿素濃度で更にゆるゆると透析するのが良いと聞いています。でも上手くいかないときは、だめです。 そんな時、2M尿素で（あまり変性させないで？）抽出させることでうまくいくことがあります。 1) 2M尿素（もしくは塩酸グアニジン）入りの抽出バッファーで抽出して、遠心上清をそのままNi-カラムに吸着させる。ここで、そこそこ抽出されれば良し。 2) カラムを2M 尿素（またはグアニジン）入りの抽出bufferで5vol程度洗浄し、その後、尿素なしのバッファーに変えて、洗浄、溶出操作を行う。ここで、可溶化されたタンパクが溶出されると良い。 3) カラムに不溶化したタンパクが残っている場合もあるので、念のため6M尿素入りで再溶出しておく。ここで回収されるようだと、残念。

(無題) 削除/引用 No.415-4 - 2011/05/21 (土) 01:09:16 - おお triton x-100などの界面活性剤をつかってみる。 アルギニンなど存在下で透析する。 DTTなどを加えてみる。

(無題) 削除/引用 No.415-3 - 2011/05/20 (金) 18:52:39 - shho あとpHもですね Hisタグ付きタンパクはあまり一般的ではない？かもしれませんが、Niカラムに結合させた状態でリフォールディングさせる方法もあるらしいです 可溶化したIBをNiカラムへ吸着させる〜変性剤濃度を徐々に落とした低濃度イミダゾールで洗浄〜変性剤なしの高濃度イミダゾールで溶出 というやり方らしいです。これを試すより前にまずは透析時の温度、pHが優先の検討事項かと思いますが･･･

(無題) 削除/引用 No.415-2 - 2011/05/20 (金) 18:44:05 - shho 透析時のタンパク濃度、温度は検討する価値あるかもしれません 目的タンパクはジスルフィド結合を持ってますか？グルタチオンを加えるのもいいかもしれません 透析前〜透析後で目的タンパク濃度がどれくらい変わってしまっているのでしょうか？

Hisタグ精製タンパク質の透析中の凝集 削除/引用 No.415-1 - 2011/05/20 (金) 18:37:41 - ママ いつも拝見させて頂いております。 Hisタグを付けた組み換えタンパク質をNiカラムで精製し、リフォルディングを行なう前に透析を行なうと、凝集する現象が起きています。 カラムで用いているwash bufferは ・20mM phosphate, 500mM NaCl, 20mM imidazole, 4M Urea pH 7.6 で、elution bufferは ・20mM phosphate, 500mM NaCl, 500mM imidazole, 4M Urea pH 7.6 ・20mM phosphate, 500mM NaCl, 2M imidazole, 4M Urea pH 7.6 です。透析は20mM phosphate,145mM NaClの、3M→1M Ureaで段階で行なっているのですが、1M Ureaにbufferを替えると凝集が起こります。 これまでに凝集を避けるために �@インダクションの温度を25℃（今までは37℃）に下げる→効果あり �AIPTGの量を0.4倍に減らした→効果あり �B透析において0.1% Tweenを入れた→効果なし 等を行なって来ましたが凝集はまだ起こり続けています。上清を回収してみましたが、濃度があまりにも低く、困っています。 凝集を完全に防ぐことは難しいとは思いますが、少しでも改善させるための知恵を貸して頂けると幸いです。

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