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(無題) 削除/引用 No.412-8 - 2011/10/21 (金) 20:10:53 - KEN ヒトの肺を固定する時は、気管からチューブをつっこみホルマリン注入を行います。点滴すたんどにつけるか、ポンプでやっています。 脱気は自然に出来てしまいます。 右の上葉には行きにくいのでチューブの位置を調整しながら入れていきます。 肺が液でパンパンにふくらむ程度になったら、そのままホルマリン固定液につけます。 ただ、気をつけないといけないのは、ホルマリンをパチャパチャ入れるとものすごい刺激で眼と鼻から涙がとまらなくなるので、静かに注入するようにご注意ください。 肺は固定前にあけると結核感染などの危険があるので、ヒト検体の場合はあけることは最近はあまり推奨されません。 免疫染色に関して、染まらない原因は固定不良以外にも様々考えられます。 ずっとぷかぷか固定できずに浮いているというのは少し論外ですが、 賦活液　賦活方法 抗体の濃度 なども考えられます。 その他プロトコールはどのようなものでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.412-7 - 2011/05/24 (火) 12:16:58 - ふに Ueno様、返信ありがとうございます。 まず色を変えてみることにします。 現在灌流固定を行ってから脱気してみたところ脱気固定のみよりも全体がより白く、かつより早く沈みました。この肺で染色してみます。 色々とご指導ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.412-6 - 2011/05/23 (月) 22:34:06 - Ueno 固定液が同じならバックに差は出ないと思います。 バックはあくまで抗体か、自家蛍光の問題だと思います。 肺で自家蛍光が問題になったことはないですが、感覚として緑色の自家蛍光が出やすい気はします。 色を変えてみたり、増感法を変えてみるのも手ではないかと。

(無題) 削除/引用 No.412-5 - 2011/05/23 (月) 20:04:23 - ふに Ueno様、返信ありがとうございます。返信が遅れてしまい申し訳ありません。 早速灌流固定で固定してみます。 あの後肺を細かく切断して脱気固定しCD31で染色してみたのですが肺組織全体が染まってしまい特異性が区別できませんでした。文献によると肺はバックグラウンドが他の組織よりも高くなるとあるのですが通常の脱気固定と灌流固定ではバックグラウンドに差は現れるのでしょうか。聞いてばかりで本当に申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.412-4 - 2011/05/21 (土) 13:56:59 - Ueno それではシリンジでの脱気と原理は同じですね。 灌流固定は右心にハサミで小さく切れ込みを入れて、左心に留置針を刺し、PBS、固定液の順番で50mlぐらいずつ数分かけて灌流させます。血管構造を保ったまま素早く固定できますよ。

(無題) 削除/引用 No.412-3 - 2011/05/20 (金) 16:10:02 - ふに Ueno様、返信ありがとうございます。 抗体に関しては失火つしている可能性はないと思われます。ラボの他のメンバーが腫瘍や肝臓で染色できているうえ、私自身もポジコンとして腫瘍や筋肉を使って染色を行いましたが問題なく染色できました。 肺の入った固定液入り小瓶を脱気瓶の中に入れ、脱気瓶とアスピレーターをつないで減圧状態にすることで脱気しています。還流固定は行ったことがないので何とも言えませんが特別な装置等は必要でしょうか。勉強不足で申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.412-2 - 2011/05/20 (金) 09:55:21 - Ueno 抗体が失活していなくて、絶対に使えるものだという保証はありますか？ あと自分がやっている固定法、抗原賦活化処理でその抗体が使えるというのも確認したほうがいいです。 アスピレーターでの脱気は私の勉強不足のせいかあまり聞いたことがありません。 シリンジを使ったピストンでの脱気や、気管に直接固定液を流し込んだりするのは昔やってました。 血管を染めるのであれば還流固定も試してみてはいかがでしょうか？ いずれにしろ、文献上ちゃんとした抗体で全く染まらないというのであれば、抗体がダメになっている可能性が一番高いのではないでしょうか。

肺組織の免疫染色 削除/引用 No.412-1 - 2011/05/19 (木) 13:56:18 - ふに いつも参考にさせていただいています。 当方、肺における血管(CD31)の染色を現在行っているのですが全く染まらず困っています。最初は浸漬固定で行っていたのですが染まらないうえに肺が浮いたままだったのですが、文献を調べたところ脱気固定を行ってから染色したほうがよいとあったのでアスピレーターを用いて肺の空気をほとんど抜きました。その後のスクロース水溶液でも同様に時間をかけると沈んだのですがCD31で全く染まりませんでした。固定時間をovernightにしたり2〜4時間に変えてみたりしたのですが結局どれも染まりませんでした。 組織染色に関してド素人ですので文献通りに従ってやっているのですが上手に肺の血管を染色するコツ等を御存じの方がおられましたら御教授していただけないでしょうか。宜しくお願いします。

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