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(無題) 削除/引用 No.411-9 - 2011/05/26 (木) 00:53:44 - tearlazy お礼の返事が遅くなってしまい申し訳ありません。 皆様さまざまな回答をありがとうございました。 cell lineに保存している細胞は再培養用にストックしていたものですので、タンパク抽出用ではありません。 その場合、皆様ほぼ一律にそのままタンパクを取るのはやめた方がいいという意見でしたので、サボらずちゃんと培養してからタンパクを抽出することにします。 本当にありがとうございました。またいろいろわからないことがありましたら質問させていただきますので、その時はよろしくお願いいたします<(_ _)>

ありがとうございました 削除/引用 No.411-8 - 2011/05/26 (木) 00:49:35 - tearlazy お礼の返事が遅くなってしまい申し訳ありません。 皆様さまざまな回答をありがとうございました。 ほぼ一律に、そのままタンパクを取るのはやめた方がいいという意見でしたので、ちゃんと培養してからタンパクを抽出することにします。 本当にありがとうございました。またいろいろわからないことがありましたら質問させていただきますので、その時はよろしくお願いいたします<(_ _)>

(無題) 削除/引用 No.411-7 - 2011/05/25 (水) 14:21:37 - おお よく分からなくなってきたのですが、凍結しそこからサンプルを得ようとしている細胞は、培養用に凍結したものですか?それともタンパク用に凍結したものですか?後者なら適切に凍結されていたならばタンパクを取るには余程難しいケースなどの場合以外は大丈夫です。ただし、凍結してからでは細胞は壊れてしまっているのでフラクションを分ける時問題があると思います。同時に凍結してから抽出するのと、凍結せずに抽出して保存しているものでは違いが出る可能性があることを一応意識して置いた方がいいです。

(無題) 削除/引用 No.411-6 - 2011/05/25 (水) 00:09:59 - ABZO ものすごく特異なケースは分からないけど、一般的にはあなたのいまの理解で全く問題ないとおもう。ラボの人は何かすごい勘違いしてるか、それか非常に特別な蛋白質を扱ってるのかもね。ただ蛋白質抽出が目的で単にcell pelletをフリーズしてるものならいいのだけれど、もしか再培養を意図してフリーズしていたものを使うとなるとあれだな、もしか血清とかそういうのが入ってることがあるよね。それだといったん溶かしてそういうのを洗い流さないと試料にそういう蛋白質とかたくさん持ち込んじゃうからマズいよね。とすると一度は融解して洗ってからでないと直接はlysis buffer入れられないね。

目的は？ 削除/引用 No.411-5 - 2011/05/21 (土) 23:53:38 - Kanata 生理的条件におかれた細胞が産生する（分泌する）蛋白質を見たいのであれば、細胞を起こすのがベストですよね。 何かの条件決定だったり、抽出条件をラフにみたい、そのための「なんでもあり」の蛋白質抽出であるなら、凍結細胞からというのもありだと思いますが。-80℃で凍結保存ということは、cell bank用に保存したものではない、という理解でＯＫでしょうか？（私の場合、液体窒素で保存するので・・・）凍結保存用の培地に血清が入っていたりするとその後の実験が厄介ですよね。

2日で大丈夫？ 削除/引用 No.411-4 - 2011/05/19 (木) 11:28:50 - ~ 再現性が求められるような実験に用いるのであれば、私ならば起こして最低3継代はしてから抽出するようにいいます。 ただ、目的が泳動用のコントロールや、精製して少量欲しいなど、物さえあればいいのであれば、溶かして凍結保護剤を洗えば取り出せると思います。

(無題) 削除/引用 No.411-3 - 2011/05/19 (木) 09:37:02 - qq １）凍結細胞の解凍後の生存率は、細胞株や凍結・保存条件で大きく変わり、コントロールが難しい。 ２）解凍した細胞を一旦、遠心してリンスするのであれば、沈殿には生存した細胞と死滅した細胞の残骸が沈殿するので、死んだ細胞の可溶性タンパク質だけを取り除いて見ていることになる。 ３）解凍後そのまま解析するのであれば、DMSOやその他の凍結保存剤の作用がどのように働くか推測困難です。 ４）そして何より、仮に良さそうな結果が得られたとして、「追試験することが困難」です。 私であれば、細胞培養のために（だよね？）凍結保存した細胞から抽出する以外に一切選択肢がなければ、 １）仕方なく、やってみる。 ２）どうせ追試できないのだから、やらない。 の選択を迫られることになります。

(無題) 削除/引用 No.411-2 - 2011/05/19 (木) 01:08:39 - おお 一般的ではないとおもいます。理屈から考えて凍結した時に発現している(分泌されたタンパク以外)は検出できると思います。 接着細胞であれば凍結の前にトリプシン処理されている可能性があります。また凍結するために徐々に温度を下げていきます。DMSOなどの凍結保護剤がはいっていたり、、、さて、凍結してある細胞は本来の生理的な機能を持つ状態で保存されていますでしょうか? そういうどうか分からないパラメーターを背負って実験するか、培養し他状態でただか2、3日を惜しむ理由があるのか、価値があるのかということだと思います。 絶対にダメとはいいませんが、上記のようなことを考慮してから実験してください。

フリーズストックからのタンパク抽出 削除/引用 No.411-1 - 2011/05/19 (木) 00:24:13 - tearlazy 当たり前のような質問かもしれませんがお願いします。 フリーズストックした細胞からのタンパクの抽出は問題ないでしょうか。 cell lineを-80℃で凍結保存しており、今度の実験でタンパクを調べたいのでフリーズストックしていた細胞からそのままタンパク抽出をしようと思ってます。 しかし、うちのラボの人に聞いてみたところ、一度起こして2日飼わないとタンパクは作らないとの答えだったので起こして２日後にタンパクを取らないとだめだよと言われました。 しかし、自分で考えたのですが、フリーズストックした場合、理論上凍結する直前まで細胞はタンパクを作っていたはずでは？？それなら直接タンパクを抽出しても問題ないように感じるのですが・・・。 よろしくお願いします。

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