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(無題) 削除/引用 No.409-8 - 2011/05/18 (水) 08:58:32 - かぐや姫 皆様、返信ありがとうございます。 おお さん データが一致しないため、関連遺伝子発現の程度を評価して・・・ と考えていくとどんどん深みにはまっていきそうで・・・ これで正しいのだろうか、と思うようになったのです。 Boston-Pullman さん 上司から『（過去のデータの）裏付けしていくように』という方針をいただき、 real time PCRとWesternが、染色の結果に一致するようなデータを求めて 研究していたのですが、どうも行き詰まってしまって・・・ 方針転換も考慮しようかと思います。 プレさん ご指摘ありがとうございます。 　1) Westernと染色の結果は、一致するのがあるべき姿 　2) mRNAは蛋白や染色と一致しないことがある ことを基本的知識として心にとめておきます。 多くの論文で、 きれいにRNA発現増加、蛋白検出、染色で差がある、などが載っているため、 それぞれ一貫性があるものと思い込んでいました。 そればかりではない、と考えられるようになりました。 ありがとうございました。 『解決』にチェック入れさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.409-7 - 2011/05/18 (水) 08:37:40 - プレ 言葉の使い方がかなり悪いですね。それと、基本的な生物学の知識が欠けています。 『物質Aがありすぎると、遺伝子や蛋白が抑制される』は意味が取れません。 RNA、蛋白、染色はこのばあい、AのｍRNA、A蛋白質、Aの免疫染色でしょう。遺伝子はDNAですよ。 A蛋白質のウエスタン＝Aの免疫染色　が普通のあるべき姿で、信用性はA蛋白質のウエスタンが高いです。 AのｍRNA量がA蛋白質量、Aの免疫染色の強さと一致しないことはよくあると思います。

(無題) 削除/引用 No.409-6 - 2011/05/18 (水) 03:49:04 - Boston-Pullman タンパク質はそれなりに機能を持っています。量的な変化で思うような結果がでなくとも、そのタンパク質が重要だと確信があるのならば、深く突っ込むべきだと思います。リン酸化で活性が変化してもバンドシフトしない（WBで）タンパク質はあります。 与えられた情報だけでは、異なるコメントが沢山出てきます。それをトピ主さんがみても、消化不良になる気がします。指導教官と納得いくまで話す必要がありそうですね。

(無題) 削除/引用 No.409-5 - 2011/05/18 (水) 01:41:32 - おお ところが、物質Aが、 　1) real time PCRで、正常＞病気 　2) Western Blottingで、正常＜病気 　3) 免疫染色で、正常＜病気 この可能性はあるのでしょうか。 あるかないかを問うと、ないとは言えないとしか言い用がないのでは? いくらでも理屈がつけれますから。タンパクが多く細胞内にあることで(もしかしたら半減期が可也のびたとか)転写にネガテイィブフィードバックがかかっているとか。 まずは一つ一つが確からしいか、確からしいと何処まで言えるか考えてみた方が良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.409-4 - 2011/05/18 (水) 01:30:03 - おお これすべて解説してたら結構な話になるような。。。 まずRNA量が変化しなくともその下流の制御が変化するとタンパク質の増減はあり得ますよね。翻訳促進、翻訳抑制、たんぱく質分解の抑制、促進、、、 でこの話はこれで打ち切っておきます。 染色で発現上昇の可能性があると見ているわけですよね。染色で発現量のさを見るのは結構難しいです。どのように比較していますでしょうか。また再現性はありますでしょうか。 上記のことがクリアーになった上でウエスタンで差がないという結論ですよね。さてこうなるとちょっと難儀です。たしかにウエスタンの定量性は精度が低い場合が多いですので、場合によってはELISAを勧める人がいるとおもいます。それはわたしも悪いことではないと思います。 WBのライセートの作り方もいろいろあるのでこれも結果に左右される可能性があります。これも結構多岐に渡ると思います。なるべく完全にタンパクを抽出する方法で差が得られないのなら、その実験精度では差をいうことは難しいと思うべきです。なのでマイルドな条件でやっているならもっと強い条件も見ておいた方がよいとおもいます。基本的には免疫染色と同じ抗体での比較をまずやるべきと思います(抗体の選択肢が限られていないのなら)。 逆にほぼ完全にタンパクが抽出できていたなら、マイルドな条件で差がないだろうかというアプローチも考えられます。発現量に差がなくても生化学的に何かさがある可能せいです。もし差があればそれがどの様に免疫染色と関係があるか探ることになるかもしれません。 生化学的なさは抽出だけでなく局在、コンプレックスの形成の状態という可能性も考えられますそれが免疫染色の染まり具合を反映しているなら量とは関係ないところが影響しているともいえると思います。そういう意味で使われている抗体の認識部位は確認してみる可能性があると思います。 加えて組織で正常と病気で何か変化があるでしょうか?繊維化がが進んで細胞が少ないとか壊死などが見られるとか。そう言うのはぶれの原因になりますので、病気の進行の具合と組織を取るタイミング(動物実験なら)を考えた方がいいかもしれません。あるいは何か適切な内部標準がないかどうか。場合によっては培養に移してから細胞(タンパク)を回収して解析するてもあるかもしれません。 思えるところはこんな所ですが、そういうふうにうまく行く確率はというと、、、高くないですね。どこまで免疫染色でクリアーな結果がて出るかによるとおもいますが、解析が非常に難しくなってきますので、ウエスタンで差が出なければ、そこでそこばかりをつついていて結果が出せるか分からないので、全くやめる必要はないでしょうけど、それに専念していていいかという判断に迫られるのではとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.409-3 - 2011/05/18 (水) 01:13:10 - かぐや姫 TSさん、早速の返信ありがとうございます。 ご指摘通り、遺伝子、蛋白は同じ物質Aのものです。 　1) 組織からRNA採取し、最終的に物質Aのprimerで、real time PCRを行った。 　2) 組織から蛋白採取し、物質Aの抗体で、Western Blottingを行った。 　3) 物質Aの抗体で免疫染色を行った。 ということです。 物質Aが 　1) real time PCRで、正常＜病気 　2) Western Blottingで、正常＜病気 　3) 免疫染色で、正常＜病気 よって、「物質Aは"正常＜病気"である」という論理を 今まで考えていました。 ところが、物質Aが、 　1) real time PCRで、正常＞病気 　2) Western Blottingで、正常＜病気 　3) 免疫染色で、正常＜病気 この可能性はあるのでしょうか。 TSさんが指摘されるように 　1) real time PCRで、正常＞病気 　2) Western Blottingで、正常＜病気 　3) 免疫染色で、正常＜病気 この（2と3で解離する）可能性は、 実験ミスと言えそうです。

(無題) 削除/引用 No.409-2 - 2011/05/18 (水) 00:36:03 - TS なんか文章の意味がとらえにくいところがあるので確認ですが、 免疫染色している物質Aと、IB、qPCRで解析しているもの（たんぱく質と遺伝子）は同じものでよいのでしょうか?　 一応、これを前提に答えます。 qPCRの結果とIHC,IBの結果は、必ずしも一致するものではないと思います。 単純に見ているものが違うので、一致してもしなくても解釈のしようがあるわけです。 ただし、IHCとIBの結果は、評価系がきちんとワークしていれば、一致しないとおかしいでしょう。同一のタンパク質を検出しているので。 これが一致しないとなると、IHCで変なものを染めてしまっているか、IBがきちんとワークしていないことを疑う必要があると思います。 ＞RNA-蛋白-染色 このあたりの表現が特に意味不明です。。。

RNA、蛋白、染色に一貫性はあるのでしょうか 削除/引用 No.409-1 - 2011/05/18 (水) 00:19:24 - かぐや姫 初めて投稿します。研究2年目です。 最近、悩んでいるのでアドバイスいただければと思います。 正常より病気のモデルで、ある物質Aが免疫染色にて染まったとします。 この時、蛋白や遺伝子も 正常より病気のモデルで上昇するのでしょうか。 実はreal time PCRやWestern Blottingをしても、 免疫染色の結果を支持するデータになりません。 たとえば、real time PCRで、『正常＜病気』、とか、 Western Blottingで、『正常＜病気』とか、一貫していないのです。 もちろん、一貫性のある物質もあります。 一貫性があれば説明にも困らないのですが・・・ 『物質Aがありすぎると、遺伝子や蛋白が抑制される』という状況を 疑いたくなるのです。 RNA-蛋白-染色に一貫性はあるものなのでしょうか。 一貫性がない時、何を証明すれば説得力があるのでしょうか。

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