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(無題) 削除/引用 No.403-5 - 2011/05/20 (金) 09:06:31 - S おおさん ありがとうございます。分泌性タンパク質なので、tagはC末に付けるのがまず最初の選択なのかなと思っておりましたが、N末も現在試しているところです。 はい。培養上清中からの目的タンパク質はウエスタンで検出できております。 確かに何かに結合してしまっているというのは、可能性あると思います。前にもう1stepを行うというの試してみたいと思います。 本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.403-4 - 2011/05/16 (月) 15:54:56 - おお 分泌タンパクのようですが、NまつCまつなどタグの位置は慎重に考えた方がいいとおもいますが、おそらくそれは考慮しているのだと思いますが。。。。 溶出されないという表現がよく分からないのですが、カラム(レジン)につかないと言うことですよね。ついて落ちてこないとなると話が違ってきます。 分泌はじゅうぶんされていると思われているわけですよね。ウエスタンするとバンドが確認されるとか(FLAGのたぐなら、anti-flagで)。 すべての分泌タンパクではないのですが、分泌された時に何かに結合ししたりして溶液中で抗原性があまりなかったりというのもあるようです。なので硫安沈殿したり、疎水クロマト(高塩濃度で結合させる)をまずとおすというストラテジーも聞いたことがあります。 抗体などでもある程度の塩濃度までは上げられますがどの程度効率に影響するか分かりません。

(無題) 削除/引用 No.403-3 - 2011/05/16 (月) 12:06:19 - S ~ さん ありがとうございます。これまで多くのタンパク質精製の実績はありますので、条件としては問題無いと考えております。 タグの位置変更は、現在行っており、興味があるところです。 3x FLAGも考えましたが、それならIg-Fcでも良いかなと考え行いましたが、ProG or ProA(この場合は結合バッファーに置換しております）で全く回収できないのが不思議でなりません。 ご指導の程、何卒宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.403-2 - 2011/05/16 (月) 11:16:35 - ~ 何か結合する実績のあるタンパク質をコントロールとして精製してみたことはありますか？ pHの調整（酸・アルカリの添加、希釈、透析等） 結合させる時間の延長（一晩） タグの位置の変更（N末、C末） タグを3xにする 界面活性剤が培地に入っていれば、無添加の培地に変える などはトラブルシューティングによく載っていると思います。

Tagを用いた可溶性タンパク精製 削除/引用 No.403-1 - 2011/05/16 (月) 10:09:26 - S 現在、リコンビナントタンパク質を培養細胞上清から精製を試みております。目的とするタンパク質は培養上清に出てくることは確認できておりますが、全く溶出されてきません。殆ど全てスルー中に残っております。具体的にはFLAGタグを用いてM2-beads精製も駄目で、IgG-Fc tagを用いてProGでの精製も駄目でした。目的タンパク質はS-S結合が２箇所あるので、その辺りの立体構造がtagの機能を阻害しているのかなと危惧しておりますが、原因が分かりません。もしどなたか改善点等、アイデアがありましたら是非お教え下さい。宜しくお願い致します。

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