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(無題) 削除/引用 No.400-6 - 2011/06/23 (木) 23:37:49 - 余計な一言 RocheによるとXtreme siRNAでcotransfectionは可能となっていますね。 https://www.roche-applied-science.com/sis/transfection/index.jsp?id=tfn_12000302 reverse法は試してみましたか？ http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/BIOCHEMI/no3_09/pdfs/18.pdf

(無題) 削除/引用 No.400-5 - 2011/06/23 (木) 09:29:00 - ~ >遺伝子Aの発現ベクターおよび遺伝子Bを標的としたsiRNA 遺伝子Aの導入効率はどのくらいなのでしょうか。 293Tでも入りにくい細胞があります。 発現ベクターが50%の細胞にしか入っていなければ、siRNAだけ100%入る事は期待できないでしょう。 また、そのsiRNA配列で期待しているレベルにまでノックダウンできる根拠はあるのでしょうか？ コトランスフェクションでなく単独で入れればもっと下がるのですか？ そうだとすれば、その条件を元に発現ベクターを入れる方向で考えられませんかね。 また、実は293TでSNPがあり、ノックダウンされるのが片方のアリルだけになっていたりしませんよね。

経過報告です。 削除/引用 No.400-4 - 2011/06/23 (木) 07:51:32 - あき これまでのところ、リン酸カルシウム法、LipofectamineLTX、XtremeGENE siRNAを試しました。 残念ながらLipofectamine2000の試供品は手に入らず、比較はできておりません。 結果は、XtremeGENE siRNAでのみ、導入Plasmidの発現と標的遺伝子のノックダウンの両方が確認されました。しかしながら、siRNAのノックダウン効率は５０％程度と不十分に思いました。 引き続き、なにか良い方法がありましたらぜひ教えていただければうれしいです。よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.400-3 - 2011/05/16 (月) 07:16:39 - おお COSや293細胞はリン酸カルシウムで条件さえ見つければ非常によく発現します。siRNAはリン酸カルシウム使う方法はやった事がありますが手前みそてきな感じでたいりょうのsiRNAを使いましたが、ききはよかったです。量的に多すぎるので経済的に現実的か分からなかったのでその後やめてしまいました。おもちのプロトコールで許容範囲かどうか一度確認されると良いと思います。 リン酸カルシウムほうは条件設定が難しいと言うのはありますので経験がないようでしたら、手元にある試薬でいいとおもいます。各社いろいろバリエーションがありますのでなんともいえませんが、COSや293などであればたいてい問題なく入ると思います。とくにsiRNAはプラスミドよりは入りやすい傾向があります。

(無題) 削除/引用 No.400-2 - 2011/05/14 (土) 14:13:09 - PYK リン酸カルシウム法は用いる細胞種にもよりますが、かなり効率悪いと思います。COS細胞で私もやったことありますが、良くて10%程度のトランスフェクション効率でした。 siRNAとプラスミドのコトランスフェクションで推奨されているのは、Lipofectamine 2000ですね。添付のプロトコールにも書いてありますし、私自身もやった時効率はほぼ100%でした。あきさんの保有しているトランスフェクション試薬では試したことはありませんね。。。まあ、やってみても良いかと思いますが。その時は結果を教えていただけると嬉しいです。

Plasmid と siRNAのコトランスフェクション 削除/引用 No.400-1 - 2011/05/14 (土) 09:21:07 - あき 293T細胞に遺伝子Aの発現ベクターおよび遺伝子Bを標的としたsiRNAをコトランスフェクションしたいと思っております。 参考にしている論文では、リン酸カルシウム法を用いていてコトランスフェクションをしておりましたが、私はリン酸カルシウム法は行ったことがありません。 現在手元にあるトランスフェクション試薬は、RocheのX-Treme GENE HPおよびQIAGENのHiPerFectですが、どなたか導入効率の良い方法をご存知の方がおられましたらぜひお教えください。よろしくお願いいたします。

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