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皆様ありがとうございます。 削除/引用 No.399-9 - 2011/05/17 (火) 12:11:58 - 東海岸ポスドク いろいろな意見ありがとうございます。 単純な細胞死計測とかではなく、特殊な蛋白を発現させている細胞株のため、parabiosisは使うことができませんが、非常に面白い手法ですね。 現在のところ、HEPES濃縮バッファーをある程度加える事により、pHを保ちつつCO2なしで24hr飼う事を検討しています。塩は血清に含まれているNa, K, Caである程度生理的に補えると思います。 目的物の検討は脂肪酸、高血糖、サイトカイン等多岐にわたるので、確かに分画を分けた方が有用かもしれません。ありがとうございます。 ひとまずトライしてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.399-8 - 2011/05/16 (月) 12:00:46 - Boston-Pullman 質問から離れてしまうのですが、parabiosis じゃ駄目ですか？

(無題) 削除/引用 No.399-7 - 2011/05/16 (月) 09:59:49 - ~ pH:炭酸インキュベーターに入れれば、どれも炭酸バッファーになり、後は平衡化した後のpHがどうなるかの問題になるかと思います。 血清ごとの差はほとんど無いと思いますので、適当な血清を用意して、濃度を振ってインキュベートした後のpHを測定すれば、適当な炭酸濃度が分かるでしょう。 HEPESはx100くらいのstock solutionが作れますので、マウス血清に入れてちょうどいいpHを調べれば使えるのかもしれません。ただ、炭酸インキュベーターを1台独占できない場合と、炭酸インキュベーターでは培養中にpHを維持できなかった場合でなければ、わざわざ試さなくてもいいのではないかと思います。 ミネラル：血液は様々なミネラルを含んでいますので、これは問題にならないと思います。これが原因だとなると、必要な成分の同定は困難で、HamF12のような微量金属の多い培地とのブレンドが前提になってくるでしょう。 その他：やってみるしかないと思いますが、問題は細胞が死ぬときに、何が足りない（又は過剰な）のかが分からないことではないでしょうか。 細胞にとって足りない（または過剰な）血清中成分の同定実験は時間がかかるでしょうから、1回培養してダメだったら他のやり方を考えたほうがいいと思います。 逆に、マウス血清100%で飼える細胞株をスクリーニングしてもいいのかもしれません。（その毒性への感受性があるかも問題ですが） 目的物は目星がついているのでしょうか。そうであれば、限外ろ過フィルター+凍結乾燥などで濃縮してから与えた方が、100%血清より高い濃度で細胞に与えることが出来るのではないでしょうか。目的物が分からなければ、分子量分画ごとに処理してもいいのかもしれません。 また、別の話ですが、人の場合は血液を採取する時間によって血中アミノ酸濃度が変わったりします。疾患モデルとWTの違いなのか、個体差なのかを示すためには、いろいろとコントロールが必要になりそうな気がします。

(無題) 削除/引用 No.399-6 - 2011/05/16 (月) 06:22:47 - おお pHは炭酸バッファーをつかわないのであれば、CO2インキュベーターにいれるとpHが下がってしまうことがあります。血清にはリン酸など含まれているとはおもいます(どれくらいかわからないですが)のでひかくてきpHは安定なのではとおもいますが、もししんぱいなら大事をとって炭酸バッファー以外のものを加えればいいかとおもいます。HEPESが前の方の指摘にもありますようによく使われますね。 またバイチをくわえると、炭酸バッファーを加えたことになることがたいていですのでフラスコなどで完全に密閉できるようなときは外でも培養可能かと思いますが、96wellとかでかうと(毒性試験だったらそれくらいの小スケールのほうが多いと思いますが)それができないですね。炭酸バッファーを使わないバイチもありますのでカタログなど参考にされるといいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.399-5 - 2011/05/16 (月) 05:48:54 - おお >[Re:4] Boston-Pullmanさんは書きました : > 血清を溶媒として、粉末の培地を溶かし込ませば、血清濃度を高めに維持できますが、どうなんでしょうね。 浸透あつとか問題が出てきませんでしょうかね。血清をバイチで透析とか考えたんですが、そうすると必要な毒性成分が抜けるでしょうし、、、

(無題) 削除/引用 No.399-4 - 2011/05/16 (月) 03:06:38 - Boston-Pullman 血清を溶媒として、粉末の培地を溶かし込ませば、血清濃度を高めに維持できますが、どうなんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.399-3 - 2011/05/15 (日) 15:39:01 - おお 血清を50%で細胞を飼うとcircadian rhythmが揃ったっていう論文を見たことがあります。100%になるとどうでしょうか。。。確かに指摘があるように細胞の生育に必要な物がそろっているか確認する必要はあるかもしれませんね。 なんとも一度予備実験をして必要な条件をクリアーするか見てみればとしか言えません。。。サプリメントが必要とかとなるとまあ90%とか80%という話にはなるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.399-2 - 2011/05/15 (日) 14:52:18 - qq 100%血清で培養できるのか、もしくは適切な培養条件と呼べるのかをわたしは知りません。 例えば、Dulbeccoの培地であれば、グルコース、ピルビン酸、アミノ酸、ビタミンと無機塩類、リン酸などなどが含まれていて、それらは培養細胞の生育におおよそ必須です。 あなたの用意するマウスの血清中に、これらの栄養素は十分に入っていると考えられますか？ もしくは、血清中に含まれる栄養素が減少しただけで、細胞の増殖が変化すると容易に想像できます。 そうすると毒性試験なのか、栄養素不足試験なのか判らなくなりそうですが、その点はいかがでしょうか？ CO2インキュベータ外で培養する時は、10-20mMのHEPES-Na（pH7 ?）を添加して密栓もしくは加湿条件で培養します。細胞の種類によるでしょうが、普通に細胞が増殖します。

100%血清での細胞培養 削除/引用 No.399-1 - 2011/05/14 (土) 05:55:53 - 東海岸ポスドク いつも大変お世話になっております。 代謝異常疾患モデルマウスの血清中の物質の毒性試験を検討しています。 細胞株を24時間treatしてその後試験予定です。 あまり希釈したくないため、可能であれば、100%血清を用いて培養したいのですが、おそらく何かしらのバッファー成分を足す必要があるか、もしくはCO2フリーの大気中で37℃で培養できないか考えております。 どなたか同様の実験の経験のある方、もしくはsuggestionを頂けますと幸いです。

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