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(無題) 削除/引用 No.396-5 - 2011/05/18 (水) 12:36:57 - おお HISはマンマルの組織や細胞では非特異(実際はHISが数個並んだエンドのタンパク)のシグナルが高いので説得力があるデーターは難しいかもしれません。N末HISタグだけ、C末HISタグだけを検出できる抗体もあるようですが、良しあしについては聞いたことがありません。 FLAG、HA、mycもそれぞれ非特異的なものがひっかかるという話を聞いたことがありますが、これは組織や研究室の実験のやり方、手癖みたいなところにも依存する可能性がありますので、これが一番いいとはいえませんが、比較的特異的なシグナルを得やすいタグではあります。HAは詳しく知らないのですがFLAGはモノクローナルが数種類出回っていますので、そういう意味では対応の幅が広いですね。mycもそうです。mycのばあいはひとcーmycのエピトープを使用しています。感度にもよりますが、ひとの細胞とかであればエンドのcーmycがひっかかってないか気にかけておいた方がいいかもしれません(ただあまりそういうケ-スを聞いたことはありませんけど)。 GFPはウエスタンで私の持っている抗体はちょっとバックグランドがでます。みなさんはもっと特異的なもの使っていると思いますが。抗体で染めるのもよくやられているのはたしかです。固定するとGFPの蛍光シグナルが弱くなりますのでそのままシグナルが見れるかは顕微鏡の感度と発現量を次第かもしれません、

(無題) 削除/引用 No.396-4 - 2011/05/17 (火) 17:01:29 - 105 >Actiasさん >実験結果を一般化して解釈 タグの影響は目的タンパクによっても変わりうるから， 実際にいくつかのタグを試してみるというのもひとつの手ですね． 「IPなら」「WBなら」「コンフォーカルなら」という一般則や経験則があったらいいですね． >FLさん >GFPがベスト ライブイメージングができて，組織でもノイズが少ないのはいいですね． >パラフィン染色など有機溶媒を使用するとGFPシグナルはなくなる パラフィン染色を余儀なくされる状況とはどんなものですか？ >FLAG, Myc, HA〜非特異的シグナルがある可能性がある endogenousなタンパクと相互作用してしまうということですか． 気をつけてみます．

(無題) 削除/引用 No.396-3 - 2011/05/17 (火) 13:45:47 - FL 個人的な意見としては 免疫染色するのであればGFPがベストです。抗体による非特異的シグナルなども気にする必要もないので。ただしパラフィン染色など有機溶媒を使用するとGFPシグナルはなくなるので、その場合はGFP抗体で染色するか、クライオセクションにするかとなります。デメリットはタグが大きいので、その影響がないかどうかはちゃんと確認しなければなりません。 FLAG, Myc, HAはどれも用途は同じで染色も免沈もできるしタグも小さいので影響は少ないと思われる。ただし、抗体の良し悪しや、組織の場合はとくに非特異的シグナルがある可能性があるので、注意しないといけない。実際に組織ではあまりこれらの使用例はGFPほどないと思います。やはり非特異が多いのかもしれません。 Hisは主に大腸菌からの大量タンパク質精製などがメインだと思います。

(無題) 削除/引用 No.396-2 - 2011/05/17 (火) 07:58:50 - Actias 後半３個の質問に対しては、「有るでしょうね｣。 手技的には、たとえばある蛋白質の免疫沈降をするとして、その蛋白質に6xHisとHAをつけた実験で結果が異なれば、タグの影響も考えられます。 それぞれのタグの性質がどうかということは、実験を始める前の情報として大事かもしれませんが、実験結果を一般化して解釈したければ、上記のように操作します。 蛋白質を精製するとしたら、それぞれのタグによって精製操作で蛋白質がさらされるpHの影響があるでしょう。

免疫組織染色．抗体タグの種類によって何が違う？ 削除/引用 No.396-1 - 2011/05/13 (金) 19:34:46 - 105 生物学初心者です． 抗体タグについていくつかわからないことがあります． ご経験者の皆さまにおかれましてアドバイスをいただけませんでしょうか？ 免疫組織染色に使用する抗体タグには， 6xHis，HA，c-Myc，FLAG，GFP などを代表して，約30種類前後あると思います． これらのタグの違いとして， サイズ（アミノ酸残基数）が違うのは自明です． わからないこと - 具体的にどんな性質の違いがあるのでしょうか？ - 染色方法に寄って使い分けるのでしょうか？ - タグ間に良し悪しがあるんでしょうか？ - マウスやハエなど宿主によって適切なタグは変わるのでしょうか？

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