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(無題) 削除/引用 No.392-18 - 2011/05/16 (月) 11:03:28 - ＳＹ 皆様、丁寧なアドバイス本当にありがとうございます。 ＞おお様 　ラボでウェスタンやってる人に聞いてみたら、メンブレンの非特異染色(何の試薬だかは聞くのを忘れてしまいました)もやっているとのことなので、教えてもらって試しにやってみることにしました。いろいろとご指導いただきありがとうございました。 ＞ab様 　すみません、割合という言葉がよくなかったのです。コントロールだとactive formのバンドが太くてinactive formのバンドが細いよね、上流因子阻害するとactive formのバンドが細くなってinactiveのバンドが太くなるよね、ということを示したいと考えていたので、半定量的な意味合いになると思うので総タンパク量を揃えるのは必要かなと思っています。 　メンブレンの染色をやってみようと思います。メンブレンはPVDFを使っています。CBB染色のプロトコルも調べてみましたが、簡単そうなので、とりあえずやってみようと思います。丁寧に説明していただきありがとうございました。 ＞B様 　アクチンやチュブリンはどんな細胞でも発現量が同じと習いましたが、本当かよと疑っていたところです。やはり経験的なものなのですね。 　タンパク濃縮についてはたまたまラボにTCAがあったので、TCA沈殿してみようと思いました。SDS-PAGE以外はやらない予定なのでTCAで問題ないと思います。丁寧な解説をありがとうございました。 解決チェックがつけられないのですが(パスワード設定し忘れたかもしれません)、解決とさせていただきます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.392-17 - 2011/05/14 (土) 09:49:49 - B 自分も最近はローディングコントロールを使うのではなくて、ウェスタン後の膜を染めて並べて出してます。ローディングコントロールって、これは量的変化はしないっぽいよねたぶんみたく経験的なもので使ってるだけだし、実際細胞の処理とか、動物の病態とかでそれが変化しないという保証ないとおもうので。あとローディングコントロールってアクチンとかもともと量が多いものが多いから、目指す蛋白質が検出できるくらいを目安にアプライすると、ローディングコントロールの蛋白質はすぐ頭打ちになってしまい、じっさい明らかに違う蛋白質量をロードしても同じ量に見えたりすることあって、これコントロールの役割してないじゃんとか思うことありまませんか。膜を染めると結構ちがいがわかるのだけど。 培地の分泌蛋白質は濃度が通常かなり薄いので濃縮が必要ですね。実験上問題ないならば無血清培地がいいですね。血清培地で濃縮しても血清蛋白質が思い切り濃縮されてしまい、電気泳動するとたぶんかなり痛い泳動像になるとおもいます。それに培地の蛋白質組成の相対的な割合は変わらないのであまり得策でないように思うので、やはり無血清培地がいいとおもいます。濃縮法はいろいろ選択肢があると思いますが、古典的なTCA沈殿、沈殿物のアセトン洗浄が無難ですかね。ただ低分子量の蛋白質だとか強塩基性蛋白質はこの方法だと沈殿しにくいのでそういうものが対象ならば注意が必要かもしれないです。

(無題) 削除/引用 No.392-16 - 2011/05/14 (土) 03:34:28 - ab > 実験の目的としてあるタンパク質の上流の活性化因子を阻害したときにactive formとinactive formの割合がどのように変化するかを調べたい ということであれば、それほどタンパク質量を揃える事に意味を感じません。割合が重要なのですから、割合の変化が見えるのであればよいのではないでしょうか。 その因子の阻害で総量が変化するということも見たいのであれば、揃えた方がよいです。 ホルモンや増殖因子などの細胞に取り込まれる因子は、コントロールには不向きな気がします。 細胞の状態（この場合は阻害の有無）によって取り込みが変化する可能性があります。 無血清培地で細胞の生存を高めるために入れるタンパク質はだいたいは取り込まれるものなので不適です。アルブミンは、ほどよい量なら使えますが、多すぎるとアルブミンの異常に太いバンドに上下のバンドがつぶされる泳動になります。これが先に言った泳動の乱れですが、アルブミンと分子量が離れている場合は問題になりません。 メンブレンを染めるのが、簡単でよいアイデアだと思いますし、論文で染色像を載せている場合もあります。ちなみにPVDF膜なら、CBBでもよく染まります。 > ローディングコントロールというものは同じtotal protein量をロードしている証拠 > 私の「なぜtotal protein量を揃えたという記述だけじゃだめか」という問いに対し先輩の答えは「文面に○マイクログラムのせたなんてのはいくらでもごまかせる。ちゃんとFigでコントロールがそろっていることを示さないと客観的とは言えない」というものでした。 よくアクチンやチューブリンをコントロールに用いますが、実際のところ異なる条件の細胞で完全に同じ量存在しているタンパク質は存在しません。そういう意味では、「FIgでコントロールがそろっていること」という先輩の意見も、揚げ足をとってしまえば、コントロールに用いる分子を変えれば「いくらでもごまかせる」と言えてしまいます。lysateの場合で一番よいのは、細胞数を揃えることだと思っています。 長文失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.392-15 - 2011/05/13 (金) 14:03:09 - おお 小出しですいません。いんビトロジェンのOPTーMEMとかインシュリン(かIGF)やトランスフェりんが添加されていたと思います。血清フリーのDMEMで何とかなっているのであれば、OPTーMEMのほうがもっといいコンディションで細胞がかえると思います。advanced DMEMなんかもグロースファクターが入ってますねたしか。

(無題) 削除/引用 No.392-14 - 2011/05/13 (金) 13:54:56 - おお >[Re:13] ＳＹさんは書きました : > > ＞おお様 > 私の「なぜtotal protein量を揃えたという記述だけじゃだめか」という問いに対し先輩の答えは「文面に○マイクログラムのせたなんてのはいくらでもごまかせる。ちゃんとFigでコントロールがそろっていることを示さないと客観的とは言えない」というものでした。 なら、トランスファーしたあとのメンブレンをアミドブラックとかでそめて量をしめしてもいいわけですよね。全体のパターンが変わらない限り同等であることが染まり具合でしめせます。60kDa辺にほぼシングルでBSAが出てくるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.392-13 - 2011/05/13 (金) 13:20:35 - ＳＹ すみません、自分では調べたり考えたりしたつもりでしたが皆さんから頂いたコメントを読むと詰めが甘いということがよくわかりました。 ＞Boston-Pullman様 ITSというのは無血清培地に添加するインスリン・トランスフェリン・亜セレン酸のことでしょうか？ 無血清培地といっても、普段DMEMにFBSを加えて培養してるものを、FBS抜きのものに変えるだけで、無血清培養用の培地に交換するという意味ではありません。説明不足で申し訳ありません。 ELISAについては詳しくないのですが、実験の目的としてあるタンパク質の上流の活性化因子を阻害したときにactive formとinactive formの割合がどのように変化するかを調べたいと考えているので、不適かなと思っています。またラボの都合上どうしてもELISAじゃなきゃだめだ！という実験系ではない限り許可が下りないのでその点でも現実的ではないです。 ＞TS様 私の勉強不足かもしれませんが、ローディングコントロールというものは同じtotal protein量をロードしている証拠、という風に解釈しているので、目的としてはTS様がおっしゃられるうちの後者ということになります。 ＞おお様 私の「なぜtotal protein量を揃えたという記述だけじゃだめか」という問いに対し先輩の答えは「文面に○マイクログラムのせたなんてのはいくらでもごまかせる。ちゃんとFigでコントロールがそろっていることを示さないと客観的とは言えない」というものでした。 それで納得してしまったので、どのように弱いか、どのようにつっこまれるのか、ということまで考えが及びませんでした。 もう少しロジカルに考えるようにしたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.392-12 - 2011/05/13 (金) 12:21:01 - おお >[Re:8] ＳＹさんは書きました : > > ＞おお様 > トランスフェリンは血清入り培地に入っているから、という意味でおっしゃられたと理解しています。 トランスフェリンは細胞の増殖に必要なので、無血清バイチには添加されていると思います。ただいろいろ工夫されて代替えできるものや方法があるのなら入ってないかもしれません。インシュリンかIGFも無血清バイチに入っていることがおおいですね。 > あと、私もtotal protein量を合わせればいいかと思っていましたが、それだけだと弱いとラボの先輩に言われたので、ローディングコントロールを探していた次第です。 こういう時はちゃんとくらいついてロジカルに説明が出来るように聞いてください。なぜよわくて、どのように弱いか。そうすると単にウエスタンでインターナルで違うタンパクで検出するだけでなくて、弱い部分を補う違う方法も探せるかもしれません。 よわいなら、論文を投稿するとレフェリーがそこをついてくるわけで、どのようにいわれて、どの様に説明できるのか、できないのか、、、その上でインターなるコントロールが必要といっているというように理解をすすめるようにしたほうがいいとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.392-11 - 2011/05/13 (金) 12:20:28 - TS なんの補正を行いたいのかによって、選択肢が変わってくると思います。 培地の量？細胞数？ ２４時間培養した後に細胞数が変わっている可能性がある、播いている細胞数にばらつきがある、ということを補正したいのであれば、培地を回収したときの細胞側の何かで補正するべきでしょう。 回収した培地をIBへ持って行くまでの処理にばらつきがでる、添加している培地の量が一定ではない、のであれば、培地中に一定量含まれているタンパク質などで補正するべきでしょう。 なんとなく、どちらかと言えば前者の補正を求めている、求められるような気がしますが。

(無題) 削除/引用 No.392-10 - 2011/05/13 (金) 11:47:27 - Boston-Pullman タイムコースや細胞数をふったデータがあれば、タンパク質量で合わせても良いと思います。 ちなみに ELISA は駄目なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.392-9 - 2011/05/13 (金) 11:30:30 - Boston-Pullman ITS 中のトランスフェリンのことだと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.392-8 - 2011/05/13 (金) 11:24:29 - ＳＹ 皆様、迅速なご返答ありがとうございます。 プロトコールの説明不足で申し訳ありませんでした。 細胞(付着系です)をコンフルエントにした後、無血清培地に交換し、24時間後に培養上清を採取、TCA沈殿でタンパクを沈殿させたあとバッファーで溶解して濃縮しようと考えています。 ＞Boston-Pullman様 血清を入れてしまうとウェスタンの時に血清由来のタンパクが多すぎて目的のタンパクが検出できないというようなことをどこかで読んだことがあるので、無血清にしようと考えていました。まだプロトコールを作っている段階なので、血清入りのサンプルも作って予備実験しようと思います。 ＞ab様 培地に関係ないタンパクを入れておくというのはすごくいいアイデアだと思いました。私のプロトコールですと、37℃24時間培養しても安定なタンパクを探して添加するということですよね。 ＞おお様 トランスフェリンは血清入り培地に入っているから、という意味でおっしゃられたと理解しています。血清入り培地を濃縮してみたことがないのでやってみないとわからないですが、まずは無血清と血清入りの両方をTCA沈殿してタンパク量を測定してみます。 あと、私もtotal protein量を合わせればいいかと思っていましたが、それだけだと弱いとラボの先輩に言われたので、ローディングコントロールを探していた次第です。

(無題) 削除/引用 No.392-7 - 2011/05/13 (金) 10:55:17 - おお ああ、たしかに脂質の影響もありそうです。アセトンで直沈殿と言うのも手として取れそうですね。あるいは硫安でBSAが来ないかすくないフラクションにクてくれれば。。。 TCAは変性の可能性がアセトンや硫安より高くないでしょうかね?

(無題) 削除/引用 No.392-6 - 2011/05/13 (金) 08:34:00 - Boston-Pullman 血清で泳動が乱れるのは脂質のせいだと思います。培養上清をTCA処理して、タンパク質を沈殿させて、アセトン処理すればかなり改善されるはずです。もちろん、TCA処理はタンパク質の濃縮も兼ねています。

(無題) 削除/引用 No.392-5 - 2011/05/13 (金) 03:20:01 - おお 小出しですいません。無血清バイチならインシュリンとか入っている場合もあります。血清ならPDGFやIgGも入っていると思いますから、同じバイチを使う限りに置いて内部標準として使えると考えてもいいかもしれません。ただ血清をつかうと非常におおいりょうのBSAが含まれているので濃縮できたとしてもタンパクが多すぎてSDSPAGEにのっけれない可能性もありますね。 また総タンパク量で合わせても問題ないと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.392-4 - 2011/05/13 (金) 02:55:58 - おお トランスフェリンとかどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.392-3 - 2011/05/13 (金) 02:28:30 - ab どんな方法でどの位濃縮するかにもよると思いますが、血清が入っているとたいていの場合は泳動がものすごいことになります。 もし血清入りの培地を用いているのであれば、目的以外のタンパク質（特にアルブミン）をできるだけ除ける方が泳動はきれいにできます。 個人的には、その細胞にまったく影響しないタンパク質（例えばIgGとかGFPとかGSTとか）を探して、培養するときに適量加えておけば、濃縮した後でもコントロールになると思います。 免疫系の細胞にはIgGは使えませんが、アイソタイプコントロールでラボによくありそうだし、GSTはリコンビナントのタンパク質を作ってるラボならベクターはありそうですよね。

(無題) 削除/引用 No.392-2 - 2011/05/13 (金) 00:44:12 - Boston-Pullman 培地（血清）中のアルブミンはどうでしょうか？

培養上清のウェスタンブロットのローディングコントロール 削除/引用 No.392-1 - 2011/05/12 (木) 20:54:14 - ＳＹ 今度ウェスタンブロットを行おうとしている実験初心者です。 サンプルは、細胞培養上清を濃縮したものを使う予定でいます。ウェスタンブロットをするときは、ローディングコントロールとしてβ-アクチンやGAPDHなどを用いると思うのですが、これはあくまでcell lysateをサンプルとして使う場合だと認識しています。 細胞培養上清をウェスタンブロットするときに、一般的に用いられるローディングコントロールはあるのでしょうか？ 勉強不足で初歩的な質問ですが、よろしくお願いします。

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