全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.391-9 - 2011/07/09 (土) 21:31:17 - KO レトロウイルスで遺伝子導入した場合に、導入した遺伝子の発現が抑制されるという話は結構聞きます。 原因としては、ゲノムの位置効果、レトロウイルスのLTRのメチル化によるサイレンシングなどが考えられます。クローニングしていないということなので、ゲノム上の様々な位置に導入された集団となっていると思いますが、レトロウイルスのLTRで遺伝子を転写させている場合、プロモーターのメチル化はゲノム上の位置に依存せずに起こるので、発現が抑制される可能性があります。 サイレンシングの起こりやすさも細胞によって異なり、胚性由来の細胞だとその効果は顕著らしいです。 それを回避するために、LTRの内部に独立した転写単位を入れて導入すると抑制効果が弱くなったということを経験しています。 あと、薬剤耐性株であっても目的遺伝子を発現していない場合もある（自分がpMXs-IBで導入した場合、薬剤耐性でも6割発現していない場合があった）ので少しでも増殖に影響が場合は、継代を長期間続けると発現していない集団が優位になることもあります。

(無題) 削除/引用 No.391-8 - 2011/05/14 (土) 12:02:19 - MP 選択マーカーは並列のプロモーターでドライブするタイプでしょうか？それともIRES？ IRESを使えば大抵の場合発現は維持されるはずですが、長期間培養で発現が低いものが選択されてくる、あるいは組み換えがおこって発現がなくなる可能性はありますね。

(無題) 削除/引用 No.391-7 - 2011/05/13 (金) 15:38:25 - ~ >3，4ヶ月間ぐらい使い続けております。それ以上必要な場合は、再度継代数の若い細胞を起こしなおしております これを2ヶ月以下にすればいい話ですよね。 いい機会ですし、他の問題が見当たらない組換え体についてもトラブルが起きないように培養期間を短くしてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.391-6 - 2011/05/13 (金) 13:32:02 - Boston-Pullman 防御機構としてのサイレンシングしか思い当たりません。 5-aza-dC で確認するのもバカバカしいですね。 その遺伝子産物は何かしら細胞にストレスを与えているのだと思います。 セレクションかけている間にICC とか IP でデータを取れないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.391-5 - 2011/05/13 (金) 10:21:04 - LY みなさま コメントありがとうございます。 細胞はマウスの不死化した繊維芽細胞を用いて、薬剤選択を常に続けております。大体一度作成した安定発現株は3，4ヶ月間ぐらい使い続けております。それ以上必要な場合は、再度継代数の若い細胞を起こしなおしております。 老化の研究ではなく、目的遺伝子を安定的に導入して、その遺伝子の結合や、局在などを研究しております。 コントロールとして同時に他の遺伝子を入れてはいないのですが、 同じ細胞、同じベクターを用いて、他の遺伝子を発現させた場合は、その発現がなくなるようなことは経験しておりませんでした。

(無題) 削除/引用 No.391-4 - 2011/05/13 (金) 09:22:02 - ~ そもそも親株であったとしても、２〜３ヶ月も培養したまま維持するのは特殊な実験だと思っていますが、細胞老化がらみの実験なのでしょうか？ コントロールとして適当な遺伝子を入れたウイルスも細胞に入れているのでしょうか。 それも落ちるのか、そちらは維持されるのかで、目的遺伝子が原因なのか、発現系や細胞系自体に問題があるのかは予想がつきますよね。 ピューロマイシンは添加し続けているのでしょうか。 添加し続けることで、隣の目的遺伝子もサイレンシングを受けにくくなると思います。

(無題) 削除/引用 No.391-3 - 2011/05/12 (木) 21:11:18 - yahoo サイレンシングはしばしば起こりえますよ。

(無題) 削除/引用 No.391-2 - 2011/05/12 (木) 21:05:20 - Boston-Pullman 未分化細胞ではサイレンシングが起こります。どんな細胞でしょうか？

レトロウイルスで組み込み遺伝子の発現抑制 削除/引用 No.391-1 - 2011/05/12 (木) 18:35:44 - LY レトロウイルスを用いて、哺乳類細胞に遺伝子を導入して、薬剤(puromycine)選択後、実験に用いております。（セレクションのみで、シングルクローンを取っておりません） これまでの経験上、安定発現株を薬剤入り培地で培養している限りは導入した遺伝子発現がなくなってしまうというようなことはなかったのですが、現在使用している遺伝子は導入後２〜３月ほど培養を続けると、発現がなくなってしまうという現象を何度か観察いたしました。 この遺伝子の導入はは、増殖などに全く影響を与えませし、高発現が細胞に悪さをするようなこも言われていない遺伝子です。 レトロウイルスなのでゲノムの入る位置は様々なはずなので、メチル化などが起こるとも考えられません。 このような現象を見られたことある方はおりますでしょうか？

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---